[发明专利]一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用，属于生物医药领域。所述胰腺癌免疫治疗耐药细胞系已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年1月8日，保藏编号为CCTCCNO:C202310。通过细胞功能学实验，发现该耐药细胞系的体外增殖、迁移能力不变，能显著抵抗T细胞的杀伤毒性；C57BL/6小鼠荷瘤实验发现，该耐药细胞系对PD‑1抗体治疗的耐受性显著增加，可用于深入研究胰腺癌PD‑1抗体治疗耐药的分子机制及开发相关抗肿瘤药物，为筛选胰腺癌PD‑1抗体治疗耐药的分子标志物、设计和评估新型抗肿瘤药物以及开发新的肿瘤治疗方案等提供新材料。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，胰腺癌的发病率在国内外均呈明显的上升趋势。胰腺癌是恶性程度很高的消化道肿瘤之一，死亡率高，预后较差。胰腺癌患者的5年总生存率不超过5％。

目前手术切除是胰腺癌患者获得治愈机会和长期生存的唯一有效方式。但由于胰腺癌进展迅速，且早期症状不典型，临床就诊时大部分患者已属中晚期。因此在诊断时可手术切除的肿瘤不超过20％，且大多数患者出现手术后复发的情况。新辅助治疗能够提高胰腺癌的可切除率并延长患者的总生存期。但即使是局部可切除的胰腺癌患者，5年总生存率也仅约为25％。基于吉西他滨的化疗是胰腺癌的标准内科治疗方法，吉西他滨与奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶的联合使用可以降低胰腺癌死亡率，但会增加药物引起的毒性副作用。因此，胰腺癌急需新的更有效的治疗方式。

近年来，以免疫检查点抑制剂PD-L1/PD-1抗体为代表的免疫治疗方法在多种癌症治疗中取得了显著的效果，但在胰腺癌的治疗中并没有展现出明显的临床获益。胰腺癌对免疫治疗呈现显著的原发耐药性，极大限制了免疫治疗的应用。研究胰腺癌免疫治疗耐药的分子机制，鉴别关键生物标志物，从而选取更加合适的免疫治疗方案，有利于提高患者生存率；同时筛选新的药物靶点，继而开发免疫治疗与靶向治疗的联合疗法，能够为胰腺癌的治疗提供新的选择。而目前尚无对PD-1抗体耐药的胰腺癌细胞株。因此，构建PD-1抗体耐药的胰腺癌细胞株显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明获得的耐药细胞系具有稳定的PD-1抗体耐药性，为后期研究胰腺癌免疫治疗耐药机制，发现新的胰腺癌治疗靶点以及开发新的胰腺癌治疗手段提供基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R，所述耐药细胞系PAN02-R已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年1月8日，保藏编号为CCTCCNO:C202310，地址为中国武汉武汉大学，分类命名小鼠胰腺癌细胞PAN02-R。

进一步地，所述耐药细胞系PAN02-R的构建方法包括以下步骤：

(1)利用胰腺癌细胞系PAN02构建C57BL/6小鼠皮下瘤模型，给予免疫检查点PD-1抗体治疗，筛选治疗后体积最大的肿瘤；

(2)无菌条件下分离筛选得到的体积最大的肿瘤组织，提取肿瘤原代细胞，对肿瘤原代细胞进行体外培养并传代，利用所述肿瘤原代细胞继续构建小鼠皮下瘤模型，给予免疫检查点PD-1抗体治疗，筛选治疗后体积最大的肿瘤；

(3)重复步骤(2)直至免疫检查点PD-1抗体治疗组的肿瘤体积与对照组相比无显著差异，筛选治疗组体积最大的肿瘤；

(4)无菌条件下分离步骤(3)中获得的肿瘤组织，提取肿瘤原代细胞，对肿瘤原代细胞进行体外培养并传代，即获得胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R。

进一步地，在步骤(1)中，所述胰腺癌细胞系为鼠源性胰腺癌细胞系。

进一步地，在步骤(2)中，所述培养基为含有10％胎牛血清的DMEM培养基。