[发明专利]一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法

权利要求书

1.一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、猪睾丸的消毒：

A、将取自农场的未成熟猪的睾丸置于50mL离心管中，并用30mL碘伏颠倒震荡清洗每个睾丸；再用30mL 75％的乙醇清洗睾丸，摇动1-2min；最后用含2％P/S青链霉素的PBS溶液清洗睾丸，摇动1-2min；

B、重复上述步骤三次；

S2、睾丸组织分离：

用大镊子将消毒后的睾丸固定在细胞培养皿中，并手术剔除附和精囊，再重复S1中A步骤一次进行清洗消毒；然后用小镊子将睾丸固定在100mm培养皿内，在白膜上水平切开，用两个小镊子剥除白膜，再用含2％双抗的PBS润湿睾丸组织；将每份0.2～0.5g的睾丸组织置于1个60mm的培养皿中，并加入共计1mL的组织消化液a，用眼科剪尽量充分的将睾丸组织成匀浆状；

S3、第一次酶消化：

在S2步骤的60mm的每个培养皿里，继续分别加入4mL组织消化液a，利用巴氏吸管将组织匀浆与组织消化液a充分混匀，并转移至15mL离心管中；在34℃，210g离心条件下进行第一次消化，计时45min；将离心后的上层清液转移至离心管一中，对上层清液、下层组织分别进行下一步处理；

S4、第一次物理分离：

A、首先，用100目和200目不锈钢筛依次对S3步骤中离心管一的上层清液中的细胞进行过滤；其次，用含10％FBS的DMEM/F-12溶液，收集100目和200目筛网上的细胞于15mL离心管中，并用DMEM/F-12培养基溶液离心漂洗3次；然后，在34℃，210g离心条件下离心15min，收集到的细胞群中即包含有睾丸间质细胞；最后，利用含10％FBS的DMEM/F-12溶液重悬上述含有睾丸间质细胞的细胞群，并接入培养皿中，做好标记后进行培养；

B、首先，将40目、100目、200、400目不锈钢筛子依次摆放，并对步骤S3中的下层组织进行依次过筛；其次，用含10％FBS的DMEM/F-12溶液进行反向冲洗，收集200目和400目筛网上截留的细胞和组织至60mm培养皿中，最后，收集至15mL离心管二中离心去除上层清液；

S5、第二次酶消化：

向S4中B步骤的去除上层清液的每个离心管二中加入组织消化液b，并在34℃，300g条件下边离心边消化，时长1h；再去除离心后的上层清液，在细胞沉淀中立即加入含有FBS的DMEM培养基，重悬细胞终止消化；

S6、第二次物理分离：

对S5步骤中重悬后悬起的细胞进行收集，并过500目筛，用含10％FBS的DMEM/F-12溶液反向冲洗，收集到的500目筛网上截留的细胞群即含有睾丸支持细胞；

然后用培养基漂洗细胞3次，用含10％FBS的DMEM/F-12溶液重悬上述含睾丸支持细胞的细胞群，并接入培养皿中，做好标记后进行培养；

S7、细胞鉴定：

对S4的A步骤中置于培养皿培养的含睾丸间质细胞的细胞群、以及对S6步骤中置于培养皿培养的含睾丸支持细胞的细胞群分别均进行形态及结构鉴定，从而实现猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法的整个过程。

2.根据权利要求1所述的一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，其特征在于，所述组织消化液a的配比为：P型胶原酶6mg、Dispase胶原酶5.5mg、HBSS+酚红5mL、PBS缓冲液5mL。

3.根据权利要求1所述的一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，其特征在于，所述组织消化液b的配比为：0.25％Trypsin，45.00mL(5mL)；DNase I，5.00mg(1mg/mL)；DMEM，9mL(90％)；FBS，1mL(10％)。

4.根据权利要求1所述的一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，其特征在于，所述10％FBS的DMEM/F-12溶液，即为含10％FBS的DMEM/F-12培养基，其中按体积百分比计，DMEM/F-12培养基占90％，FBS占10％。

5.根据权利要求4所述的一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，其特征在于，所述DMEM/F-12培养基为1:1的液体培养基，其生产厂家为Cytiva，货号为SH30023.01。