[发明专利]一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法

说明书

本发明公开了一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，包括S1猪睾丸的消毒、S2睾丸组织分离、S3第一次酶消化、S4第一次物理分离、S5第二次酶消化、S6第二次物理分离、S7细胞鉴定等步骤，从而实现猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法的整个过程。本发明一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，操作简单方便，分离出来的猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞均一度较高，无需其他纯化措施后续培养稳定性好，分离效率高；同时在细胞污染、分离纯化和鉴定、细胞质数量及量、分离法成本等方面均能够得到有效控制，有利于推广应用。

技术领域

本发明涉及细胞分离培养技术领域，具体为一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法。

背景技术

细胞是动物机体的基本的结构和功能单位。细胞的分离是所有相关生物领域研究的必要步骤。同样，细胞决定了所有研究领域的命运。随着技术的进步和所有相关领域的发展，掌握多样的细胞分离技术、降低劳动力成本、劳动时间、试剂成本和提高自动化程度显得至关重要。

从睾丸组织中分离细胞多采用多种分离法(酶消化法、机械法、酶消化和机械法结合，有的通过酶消化和过筛、有的用酶消化和梯度液)。各种分离法中的酶、浓度、筛子规格、还有消化及处理时间均有一定的差异。我们经过多年相关雄性分离培养支持细胞和间质细胞的研究积累，目前已经能够单独分离均一度达于90％以上的支持细胞和间质细胞。

体外培养支持细胞和间质细胞已成为研究睾丸机能、生殖毒理的重要细胞模型。同时对猪睾丸分离两种生殖细胞的技术目前还未见报道。多数的研究报道中都得经过低渗处理法Tris-HCL、差速贴壁法、消化法、反复抽吸生殖细胞、荧光激活细胞分选、密度梯度离心不连续梯度换培养液的饥饿方法等，多种纯化才能获得较高的均一度，但是细胞污染、分离纯化、鉴定方面、分离效率、细胞质数量及量、分离法成本、操作难易程度等方面任然存在着问题。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，以解决以上缺陷。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，包括以下步骤：

S1、猪睾丸的消毒：

A、将取自农场的未成熟猪的睾丸置于50mL离心管中，并用30mL碘伏颠倒震荡清洗每个睾丸；再用30mL 75％的乙醇清洗睾丸，摇动1-2min；最后用含2％P/S青链霉素的PBS溶液清洗睾丸，摇动1-2min；

B、重复上述步骤三次；

S2、睾丸组织分离：

用大镊子将消毒后的睾丸固定在细胞培养皿中，并手术剔除附和精囊，再重复S1中A步骤一次进行清洗消毒；然后用小镊子将睾丸固定在100mm培养皿内，在白膜上水平切开，用两个小镊子剥除白膜，再用含2％双抗的PBS润湿睾丸组织；将每份0.2～0.5g的睾丸组织置于1个60mm的培养皿中，并加入共计1mL的组织消化液a，用眼科剪尽量充分的将睾丸组织成匀浆状；

S3、第一次酶消化：

在S2步骤的60mm的每个培养皿里，继续分别加入4mL组织消化液a，利用巴氏吸管将组织匀浆与组织消化液a充分混匀，并转移至15mL离心管中；在34℃，210g离心条件下进行第一次消化，计时45min；将离心后的上层清液转移至离心管一中，对上层清液、下层组织分别进行下一步处理；

S4、第一次物理分离：