[发明专利]一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法

权利要求书

1.一种副产物减少的生产丁二酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌中敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhA、转录因子基因iclR、异柠檬酸脱氢酶基因icd、丙酮酸脱氢酶基因poxB、丙酮酸脱氢酶基因ptsG，并过表达柠檬酸合酶基因gltA与异柠檬裂解酶基因aceA。

2.根据权利要求1所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述琥珀酸脱氢酶基因sdhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述转录因子基因iclR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述异柠檬酸脱氢酶基因icd的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述丙酮酸脱氢酶基因poxB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述丙酮酸脱氢酶基因ptsG的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；所述柠檬酸合酶基因gltA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述异柠檬裂解酶基因aceA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.根据权利要求2所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)或MG1655。

4.根据权利要求1-3任一所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，将SEQ ID NO.9所示组成型启动子PUTRinfc-rplt与所述柠檬酸合酶基因gltA和异柠檬裂解酶基因aceA连接到载体pCDFDuet-1上。

5.一种构建权利要求4所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)通过CRISPR/CAS9敲除大肠杆菌BL21(DE3)中sdhA、iclR、icd、poxB和ptsG基因，获得敲除上述基因的基因工程菌；

(2)将SEQ ID NO.9所示组成型启动子PUTRinfc-rplt与SEQ ID NO.7所示柠檬酸合酶基因gltA的基因片段、SEQ ID NO.8所示异柠檬裂解酶基因aceA的基因片段连接到pCDFDuet-1载体上获得重组载体，并将重组载体转入步骤(1)的基因工程菌中。

6.一种有氧条件下生产丁二酸的方法，所述方法是将权利要求1～4任一所述的大肠杆菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述发酵培养基按g/L计，含有Na₂HPO₄ 6～8，KH₂PO₄ 2～4，NH₄Cl 0.5～1.5，NaCl 0.5～1，MgSO₄ 0.15～0.3，CaCl₂ 0.1～0.2，胰蛋白胨7～8，酵母粉2～3，葡萄糖8～9。

8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～40℃，发酵20～50h。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述发酵的转速为200-250r/min。

10.权利要求1～4任一所述大肠杆菌工程菌或权利要求6～9任一所述方法在制备丁二酸或含丁二酸的产品方面的应用。