[发明专利]一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程领域。本发明在大肠杆菌BL21(DE3)中连续敲除sdhA,iclR,icd,poxB和ptsG，并在该工程菌中组成型过表达gltA‑aceA，最终该工程菌B6‑gltA‑aceA在摇瓶发酵中丁二酸的产量达到了4.49g/L,达到理论转化率的85.6％，产率较基因工程菌B1提高了855.3％，同时乙酸积累量为0.24g/L，有利于丁二酸的工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

丁二酸又称琥珀酸，分子量为118.088，是一种无色晶体，是生物体内三羧酸循环过程中的重要代谢中间产物，也是一种重要的C4平台化合物，常用于合成通用化学品的起始原料，如1,4-丁二醇、四氢呋喃、丁二腈、丁二酸酐和2-吡咯烷酮等，因此被广泛应用于食品、医药、农业领域。此外，丁二酸作为重要的有机合成中间体，广泛应用于合成多种可降解聚酯，如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)和聚丁二酸己二醇酯(PHS)等。PBS与其他生物可降解塑料相比不仅力学性能十分优异，且价格十分合理，市场需求量大，全球多个国家和地区开始实施“禁塑、限塑”政策，生物可降解材料迎来较好的发展机遇，专家估计未来我国PBS年需求量将达到300万吨以上，按生产1吨PBS需要0.62吨丁二酸计算，一年需要消耗丁二酸180万吨，而从全球丁二酸产能数据来看，2021年我国丁二酸产能约5.5万吨，全球占比48％，受限于工艺技术和成本等问题，目前丁二酸市场规模仍较低，产能远远达不到市场需求。

随着代谢工程和合成生物学的快速发展，使用污染小、成本低、可持续的生物法生产丁二酸受到研究者的广泛关注，大肠杆菌因其遗传背景清晰、易于改造、易于培养及利用碳源等诸多优点被选作最有潜力的丁二酸生产菌株，在有氧情况下，细胞能快速生长，并积累大量菌体，但是有氧情况下不能积累丁二酸，且添加大量葡萄糖发酵易发生乙酸溢流。因此，在添加底物葡萄糖的情况下，使大肠杆菌在快速生长的同时积累丁二酸，并减少副产物乙酸的积累是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明通过代谢工程改造在大肠杆菌BL21(DE3)中连续敲除sdhA,sdhB,iclR,icd,poxB,ptsG基因中的一个或是多个，并以pCDFDuet-1为表达载体组成型过表达来源于大肠杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)和异柠檬裂解酶基因(aceA)，使大肠杆菌在有氧条件下能大量积累丁二酸，并降低副产物乙酸的含量。

本发明的第一个目的是构建有氧生产丁二酸的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌中敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhA、转录因子基因iclR、异柠檬酸脱氢酶基因icd、丙酮酸脱氢酶基因poxB、丙酮酸脱氢酶基因ptsG，并过表达柠檬酸合酶基因gltA与异柠檬裂解酶基因aceA。

本发明还提供了构建所述大肠杆菌工程菌的方法，包括如下至少一个步骤：

(1)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)中敲除如SEQ ID NO.1所示基因sdhA(琥珀酸脱氢酶)，所得缺失sdhA基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)△sdhA命名为B1。

(2)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)△sdhA中敲除如SEQ ID NO.2所示基因sdhB(琥珀酸脱氢酶)，所得缺失sdhB基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)△sdhA△sdhB命名为B2。

(3)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)△sdhA中敲除如SEQ ID NO.3所示基因iclR(转录因子)，所得缺失iclR基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)△sdhA△iclR命名为B3。

(4)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)△sdhA△iclR中敲除如SEQ IDNO.4所示基因icd(异柠檬酸脱氢酶)，所得缺失icd基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)△sdhA△iclR△icd命名为B4。