[发明专利]一种区分病原体DNA/RNA的核酸检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种区分病原体DNA/RNA的核酸检测方法及试剂盒，在引物5’端引入一段人工序列以提高引物特异性，所述人工序列与模板不互补，所述人工序列与引物3’端序列互补形成茎环结构，当模板与引物3’端不完全互补时引物以茎环结构存在，当模板与引物3’端完全互补时，茎环结构解链进行逆转录；在扩增RNA时，使合成的cDNA带有所述人工序列，在扩增时引物与cDNA完全互补，引物3’端有7‑11个碱基与模板互补，引物3’端使用脱氧尿嘧啶替代脱氧胸腺嘧啶碱基。本发明在一定的退火温度下，在扩增DNA时由于引物结合的Tm值较低使DNA无法扩增，而在扩增RNA时，由于逆转录引物5’端带有人工的序列，使合成的cDNA带有该人工序列，在扩增时引物可与cDNA完全互补，可准确检测RNA。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种区分病原体DNA/RNA的核酸检测方法及试剂盒。

背景技术

病原体是指经传播侵入宿主后，能够引起疾病的传染性微生物或生物性病原媒介，包括细菌、真菌、病毒、类病毒等，食物、水源、土壤等均可携带病原体。若人长期暴露于病原体环境中或进食病原体污染过的食物、水源，会导致人体产生疾病。病原体感染能够引起人呼吸道、消化道、生殖道等多种疾病。及时筛查出致病菌，对疾病的治疗具有重要意义。

目前，大多数病原体诊断方法主要有培养法、免疫学诊断法和分子生物学诊断法。培养法是病原体的实验室诊断常规方法，传统培养法特异性和敏感性高，但临床检测时间长(至少需要24-48h)，过程繁琐，且阳性率受到多种因素影响，不适用于大范围检测。血清学方法由于窗口期的存在，诊断存在滞后性，不能准确反映当前是否感染，虽然特异性高，但是敏感性不够，检测率较低。分子诊断学方法包括基因序列测序及核酸检测方法，其中基因序列测序具有成本昂贵，步骤复杂繁琐，耗时长等缺点，不适宜临床检测用。而病原体核酸荧光PCR检测法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点。但由于DNA结构稳定，在细菌死亡后可保持很长时间为阳性，无法判断病原体感染的具体阶段，造成过度治疗。而RNA半衰期短，在菌死亡之后会快速降解，单独对病原体RNA进行检测，可以区分细菌的活性，同时由于RNA在非病毒性病原体微生物细胞中存在多拷贝，与以DNA为靶标的PCR等技术相比，其灵敏度和准确性更高。RNA不仅具有核酸检测的快速灵敏度高等优点，还可以筛掉死菌，提供更精准的检测，适合临床筛查及诊断。

而对于RNA检测技术，目前主要的挑战之一在于如何排除样本中的DNA干扰，维持RNA的稳定，并确保灵敏度与准确性。

RT-qPCR技术是一项较早应用于临床检测的成熟分子检测技术，在临床上应用广泛，但用于部分RNA检测存在一定局限性，主要原因有：①DNA消化步骤不可避免地导致RNA损耗，降低检测的灵敏度；②消除不彻底时，残留的DNA和RNA一同被扩增，影响定量的准确性。

目前国外检测RNA使用较多的是1995年Gen-Probe公司推出的赖转录介导扩增(Transcription mediated amplification,TMA)技术，该技术中使用的MMLV逆转录酶与T7RNA聚合酶可以在恒温的条件下进行扩增，扩增出的产物RNA再由配套的杂交保护试验进行终点定性检测。该技术可以对RNA进行检查，具有较高的灵敏性，但终点TMA方法在实际应用过程中易引起扩增无的污染，因此常造成假阳性的实验结果使得该技术在实际临床检测中具有较大的局限性。

上海仁度推出的同步扩增检测技术(Simultaneous Amplification andTesting,SAT)，扩增原理与TMA类似，但SAT在检测过程中引入分子信标，不需要扩增后开盖进行终点测试，在一定程度上降低了污染的可能性，但该技术存在不稳定性，易受多种因素影响而使扩增失败。在使用过程中也需要在逆转录后开盖添加T7 RNA聚合酶，操作上较为繁琐。受限于检测荧光通道数，目前还未有多重检测产品上市。