[发明专利]支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4及其建立方法

权利要求书

1.支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)野猪肺细胞的复苏与亚克隆，野猪肺细胞种细胞进行培养和细胞传代，第二代细胞采用有限稀释法进行单细胞克隆，待克隆长成野猪肺细胞簇，得到野猪肺细胞单细胞克隆株；

(2)评估非洲猪瘟病毒对野猪肺细胞单细胞克隆株的易感性，通过重组非洲猪瘟病毒感染，评估不同野猪肺细胞单细胞克隆株的易感性，定向选择非洲猪瘟病毒易感性好的野猪肺细胞单细胞克隆株；

(3)野猪肺细胞的连续亚克隆和定向筛选，将步骤(2)中筛选得到的非洲猪瘟病毒易感性好的野猪肺细胞单细胞克隆株进行再次亚克隆和定向筛选，通过连续四轮野猪肺细胞单细胞克隆株的亚克隆和定向筛选，选择以重组非洲猪瘟病毒感染后产生绿色荧光蛋白阳性细胞数目多且荧光强度高的单细胞克隆株，获得了非洲猪瘟病毒感染效率高的野猪肺细胞单细胞克隆株WSL-R4。

2.如权利要求1所述的支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4的建立方法，其特征在于，步骤(1)中野猪肺细胞种细胞使用含有10％FBS和100ug/mL青链霉素双抗的RPMI-1640培养基中进行培养，生长48-72h，待细胞长至单层后用胰酶消化。

3.如权利要求2所述的支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4的建立方法，其特征在于，步骤(1)中第二代细胞采用有限稀释法在96孔板内进行单细胞克隆，消化后的野猪肺细胞计数后稀释至5-10个细胞/毫升，将稀释好的野猪肺细胞铺于96孔板，0.1mL/孔，约每孔0.5-1个细胞，37℃下含5％CO₂的培养箱内培养观察7-10天，待亚克隆长成野猪肺细胞簇，用胰酶消化。

4.如权利要求1所述的支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4的建立方法，其特征在于，步骤(2)中野猪肺细胞单细胞克隆株生长融合度达到80-90％，按照感染复数(MOI)＝1接种重组非洲猪瘟病毒，37℃，5％CO₂培养箱中吸附1.5h，更换含有2％FBS和100ug/mL青链霉素双抗的RPMI-1640维持液，培养箱中继续培养，分别在感染24h和48h在荧光显微镜下观察，根据不同野猪肺细胞单细胞克隆株感染重组非洲猪瘟病毒后产生绿色荧光蛋白的强度及细胞个数评估野猪肺细胞单细胞克隆株的感染效率。

5.支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4，如权利要求1-4任一项所述的支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4的建立方法获得，其特征在于，所述支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4的保藏编号为CGMCC45484。