[发明专利]支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4及其建立方法

说明书

本发明公开了支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL‑R4及其建立方法，属于非洲猪瘟病毒技术领域。本发明采用有限稀释法对野猪肺细胞进行亚克隆，最终获得一株能够支持非洲猪瘟病毒高效复制单细胞克隆株WSL‑R4，该细胞株性能稳定，能够支持非洲猪瘟病毒野毒株及缺失毒株复制，病毒滴度最高可达10supgt;6/supgt;TCIDsubgt;50/subgt;/mL，在非洲猪瘟病毒基础研究与疫苗生产中具有很好的应用价值。

技术领域

本发明是关于非洲猪瘟病毒的技术领域，特别是关于体外高效增殖的非洲猪瘟病毒野猪肺细胞系及其建立方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒(ASFV)是严重危害我国及世界养猪业的头号杀手，目前尚无安全有效的商品化疫苗及抗病毒药物。ASFV具有严格的细胞嗜性，主要感染猪单核-巨噬细胞系统。猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)是体外研究ASFV复制、生物学特性，以及疫苗生产的主要细胞，然而其制备过程繁琐、易造成细菌和外源病毒污染，无法传代培养，且批次间重复性差。自上世纪末至今，研制支持ASFV高效复制的体外传代细胞系一直是本领域的热点，已发现非洲绿猴肾细胞(MA104)、猪肾巨噬细胞(IPKM)、绿猴肾细胞(VERO)人胚胎肾细胞(HEK-293)和野猪肺细胞(WSL)等均可在一定程度、条件下支持ASFV增殖，但仍存在病毒复制效率低下(滴定不超过10^4.5TCID₅₀/mL)、连续传代病毒会导致其基因组发生大片段缺失(MGF家族基因)、失去对靶细胞的易感性等问题，无法广泛应用于ASFV基础研究和应用研究，尚需继续研制可支持ASFV高效复制的猪源传代细胞系，为基础研究与疫苗产能提升提供重要生物学材料。

野猪肺细胞(WSL)属于野猪肺细胞，来源于野猪肺脏组织，属于可连续传代的上皮样细胞，可规避PAMs制备和培养过程中的各种弊端。研究显示ASFV可以感染WSL细胞，但是存在病毒感染效率差、增殖滴度受限的问题，尚不能满足ASFV研究所需。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供体外高效增殖的非洲猪瘟病毒野猪肺细胞系及其建立方法，其能够野猪肺细胞感染效率差和病毒滴度低的问题。

为实现上述目的，本发明提供了支持非洲猪瘟病毒体外高效增殖的野猪肺细胞系WSL-R4的建立方法，包括以下步骤：

(1)野猪肺细胞的复苏与亚克隆，野猪肺细胞种细胞进行培养和细胞传代，第二代细胞采用有限稀释法进行单细胞克隆，待克隆长成野猪肺细胞簇，得到野猪肺细胞单细胞克隆株；

(2)评估非洲猪瘟病毒对野猪肺细胞单细胞克隆株的易感性，通过重组非洲猪瘟病毒感染，评估不同野猪肺细胞单细胞克隆株的易感性，定向选择非洲猪瘟病毒易感性好的野猪肺细胞单细胞克隆株；

(3)野猪肺细胞的连续亚克隆和定向筛选，将步骤(2)中筛选得到的非洲猪瘟病毒易感性好的野猪肺细胞单细胞克隆株进行再次亚克隆和定向筛选，通过连续四轮野猪肺细胞单细胞克隆株的亚克隆和定向筛选，选择以重组非洲猪瘟病毒感染后产生绿色荧光蛋白阳性细胞数目多且荧光强度高的单细胞克隆株，获得了非洲猪瘟病毒感染效率高的野猪肺细胞单细胞克隆株WSL-R4。

优选地，步骤(1)中野猪肺细胞种细胞使用含有10％ FBS和100ug/mL青链霉素双抗的RPMI-1640培养基中进行培养，生长48-72h，待细胞长至单层后用胰酶消化。

进一步地，步骤(1)中第二代细胞采用有限稀释法在96孔板内进行单细胞克隆，消化后的野猪肺细胞计数后稀释至5-10个细胞/毫升，将稀释好的野猪肺细胞铺于96孔板，0.1mL/孔，约每孔0.5-1个细胞，37℃下含5％CO₂的培养箱内培养观察7-10天，待亚克隆长成野猪肺细胞簇，用胰酶消化。