[发明专利]共同检测RA和PM的引物探针组合物、方法及试剂盒

权利要求书

1.用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括用于检测鸭疫里默氏杆菌的引物探针组合物1和/或用于检测多杀性巴氏杆菌的的引物探针组合物2；所述引物探针组合1物包括正向引物RA-F、反向引物RA-R和探针RA-P，所述正向引物RA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物RA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述探针RA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述引物探针组合物2包括正向引物Pm-F、反向引物Pm-R和探针Pm-P，所述正向引物Pm-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物Pm-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述探针Pm-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针RA-P的5′端连接FAM，3′端连接C3阻断基团；所述探针Pm-P的5′端连接Digoxin，3′端连接C3阻断基团；所述探针RA-P的第34位A和第35位T之间插入THF；所述探针Pm-P的第31位T和第32位G之间插入THF；所述反向引物RA-R和所述反向引物Pm-R的5′端连接Biotin。

3.用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的反应体系，其特征在于，所述反应体系包含权利要求1-2任一项所述的引物探针组合物。

4.根据权利要求3所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系为50μL，包括29.4μLRehydration buffer、1.0μL RA-F、1.0μL RA-R、1.0μL Pm-F、1.0μL Pm-R、0.3μL RA-P、0.3μL Pm-P、9.5μL ddH₂O、2.0μL pMD19-T-OmpA、2.0μL pMD19-T-Kmt1、2.5μL MgOAc、1管nfo kit RPA扩增试剂冷冻干粉。

5.用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-2任一项所述的引物探针组合和/或权利要求3-4任一项所述的反应体系。

6.利用权利要求1-2任一项所述的引物探针组合物、权利要求3-4任一项所述的反应体系和/或权利要求5所述的试剂盒共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的RPA-LFD方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取待测样品基因组DNA；

S2：以S1所得DNA为模板，利用所述引物探针组合物进行扩增，获得反应液；

S3：采用双标核酸检测试纸条检测S2所得反应液，根据检测结果判定样本中是否含有鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S2中，反应温度为25℃-42℃，扩增时间为15min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S3具体为：取10μL反应液和190μL ddH₂O混合均匀，将双标核酸检测试纸条的样本端插入混合液中进行反应待出现结果后于5min内读取试验结果。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，若试纸条上仅质控线显色，表明结果为阴性，样本中不含鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌；若试纸条上质控线和检测线T1同时显色，表明结果为阳性，样本中含有多杀性巴氏杆菌，不含鸭疫里默氏杆菌；若试纸条上质控线和检测线T2同时显色，表明结果为阳性，样本中含有鸭疫里默氏杆菌，不含多杀性巴氏杆菌；若试纸条上质控线、检测线T1和检测线T2同时显色，表明结果为阳性，样本中同时含有多杀性巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌。

10.权利要求1所述的引物探针组合物在制备用于检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的试剂盒中的应用。