[发明专利]共同检测RA和PM的引物探针组合物、方法及试剂盒

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共同检测RA和PM的引物探针组合物、方法及试剂盒。本发明设计了共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物和探针，并结合LFD技术构建一种可以同时检测出流行于国内养殖场内鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的RPA‑LFD试剂盒和方法，相关引物和探针序列如SEQ ID NO：1～6所示。本发明的双重RPA‑LFD检测方法和试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、效率高等特点，是一种理想的鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检测方法，对禽类养殖业中病原菌的有效防控具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共同检测RA和PM的引物探针组合物、方法及试剂盒。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是危害肉鸭养殖业的主要病原之一。鸭疫里默氏杆菌病在发病场能持续存在，引起不同批次的鸭感染发病，难于根治；并且耐过鸭常生长不良，增重缓慢，失去饲养价值，给养鸭业造成了严重的经济损失。多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，PM)是引起多种动物巴氏杆菌病(又称出血性败血症)的病原菌，主要使动物发生出血性败血症或传染性肺炎。禽类中以鸭对多杀性巴氏杆菌最易感，其次是鸡、鹅；畜类中则以猪最常见，其次是牦牛、黄牛、水牛。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而RPA反应在常温下即可进行，无需变性，检测速度更快，是一种便携式的快速核酸检测方法，且该技术对硬件设备的要求很低，适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

现有技术中，已有单一检测鸭疫里默氏菌或多杀性巴氏杆菌的RPA-LFD方法，以及同时检测鸭疫里默氏菌和多杀性巴氏杆菌的PCR方法，例如，公开号为CN106811541A的发明专利公开了一种基于RPA-LFD方法的现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒，该发明最低可以检测到6拷贝/反应的多杀性巴氏杆菌DNA；公开号为CN105886654B的发明专利公开了一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法，致病菌为鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌，该发明提供了一种使用一对引物区别鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR方法。

目前，现有技术中缺乏基于RPA-LFD技术同时检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物探针组合物，该引物探针组合物可实现鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的共同RPA-LFD检测，具有特异性强、敏感高等特点。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括用于检测鸭疫里默氏杆菌的引物探针组合物1和/或用于检测多杀性巴氏杆菌的的引物探针组合物2；所述引物探针组合1物包括正向引物RA-F、反向引物RA-R和探针RA-P，所述正向引物RA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物RA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述探针RA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述引物探针组合物2包括正向引物Pm-F、反向引物Pm-R和探针Pm-P，所述正向引物Pm-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物Pm-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述探针Pm-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

进一步，所述探针RA-P的5′端连接FAM，3′端连接C3阻断基团；所述探针Pm-P的5′端连接Digoxin，3′端连接C3阻断基团；所述探针RA-P的第34位A和第35位T之间插入THF；所述探针Pm-P的第31位T和第32位G之间插入THF；所述反向引物RA-R和所述反向引物Pm-R的5′端连接Biotin。