[发明专利]一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对，其特征在于，包括BVDV-F和BVDV-R，所述BVDV-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述BVDV-R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种包含权利要求1所述RPA引物对的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、无菌去离子水和SYBRGreenI荧光染料。

4.根据权利要求2或3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SEQ ID No.1所示的重组质粒；所述阴性对照为无菌去离子水。

5.权利要求1所述RPA引物对或权利要求2～4任一项所述试剂盒在制备检测牛病毒性腹泻病毒的工具中的应用。

6.一种非诊疗目的的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样本基因组RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用权利要求1所述RPA引物对或权利要求2～4任一项所述试剂盒配制反应体系，进行RPA扩增反应，根据扩增产物判断是否存在牛病毒性腹泻病毒。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述反应体系以50μL计，包括：2μL模板、11.2μL无菌去离子水、29.5μLRPA反应缓冲液、上下游引物各2.4μL，2.5μL醋酸镁溶液和4mgRPABasic冻干粉。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述RPA扩增反应的温度为37～41℃，所述RPA扩增反应的时间为20～40min。

9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，当利用荧光染料的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，将SYBRGreenI荧光染料与扩增产物混合，用395nm波长的紫外照射，若扩增产物呈现荧光，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物不呈现荧光，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒；

当用肉眼观察，若扩增产物颜色变化为绿色，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物颜色不变，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。

10.根据权利要求6或9所述方法，其特征在于，当采用电泳的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，若出现208bp目的条带，即为阳性反应，表示样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若没有出现208bp目的条带，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。