[发明专利]一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法，涉及分子检测技术领域。本发明所述RPA引物对，包括BVDV‑F和BVDV‑R，其特异性强、敏感性好。本发明还基于所述RPA引物对构建了可视化试剂盒，该试剂盒具有仪器设备要求低、操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为BVD的现场可视化检测提供新方法，适合于口岸或样品中病原病毒的现场检测。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)是一种正义的核糖核酸(RNA)病毒，属于黄病毒科瘟病毒属，可以引起牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovine ViralDiarrhea-Mucosal Disease，BVD-MD)。BVD是一种急性、热性、接触性传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎、致死性粘膜病为主要特征。目前，BVDV严重威胁我国甚至全球的畜牧业发展，造成极大的经济损失，因此BVDV的检测及预防有着十分重要的意义。

目前，检测BVDV的方法包括血清学中和试验、细胞分离培养、酶联免疫吸附试验、PCR技术等。血清学方法存在费时、费力、准确率低等缺点。我国诊断BVDV国家标准技术采用细胞分离法，但其费时费力、病毒分离率低，且非致细胞病变型BVDV并不出现细胞病变。分子生物学的检测方法存在假阳性、环境污染、重复性不高等不足。因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为该病的现场诊断提供新一代的检测技术与手段。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是不同于PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶三种酶参与。RPA温度要求低，反应短时间短、操作简单，不需要特殊设备。在反应体系中嵌入SYBR Green I染料可直接用于检测DNA产物，根据色差对结果进行判读。目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，并没有关于BVDV的检测相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法，特异性强，灵敏度高，可用于现场可视化检测。

本发明提供了一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对，包括BVDV-F和BVDV-R，所述BVDV-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述BVDV-R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种包含上述RPA引物对的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。

优选的，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、无菌去离子水和SYBR Green I荧光染料。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SEQ IDNo.1所示的重组质粒；所述阴性对照为无菌去离子水。

本发明还提供了上述RPA引物对或上述试剂盒在制备检测牛病毒性腹泻病毒的工具中的应用。

本发明还提供了一种非诊疗目的的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的方法，包括以下步骤：提取样本基因组RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用上述RPA引物对或上述试剂盒配制反应体系，进行RPA扩增反应，根据扩增产物判断是否存在牛病毒性腹泻病毒。

优选的，所述反应体系以50μL计，包括：2μL模板、11.2μL无菌去离子水、29.5μLRPA反应缓冲液、上下游引物各2.4μL，2.5μL醋酸镁溶液和4mg RPABasic冻干粉。

优选的，所述RPA扩增反应的温度为37～41℃，所述RPA扩增反应的时间为20～40min。