[发明专利]一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用

权利要求书

1.一种用于检测牛呼吸系统疾病的五种病原体牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(BPIV 3a和BPIV 3c)的N基因、牛支原体(M.b)的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌(P.m)的ompH、A型的hyaC-hyaD、B型的bcbD基因的LAMP引物组合，其特征在于，所述引物组合包括内引物对F3/B3、内引物对FIP/BIP、环引物对LF/BF，其中

⑴IBRV的gB基因

表1

⑵BRSV的N基因

表2

⑶BPIV-3a和BPIV-3c N基因表3

表4

⑷M.b的oppD/F

表5

⑸Pm.b的引物组合

①ompH基因

表6

②A型牛多杀性巴氏杆菌hyaC-hyaD引物组表7

③B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域引物组

表8

2.如权利要求1所述用于检测牛呼吸系统五种病原体IBRV、BRSV、BPIV 3a、BPIV3c、M.b、P.m特异基因的LAMP引物组合，其特征在于，

IBRV：所述引物组合是针对牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因保守区设计；

BRSV：所述引物组合是针对牛合胞体病毒的N基因保守区设计；

BPIV 3a和BPIV3c：所述引物组合是针对牛副流感病毒3型的N基因保守区设计；

M.b：所述引物组合是针对牛支原体的oppD/F基因保守区设计；

P.m(A、B血清型)：所述引物组合是针对牛多杀性巴氏杆菌ompH基因保守区设计，可判断是否是P.m；针对A型的荚膜hyaC-hyaD，B型的荚膜bcbD基因的引物组合，可对P.m进行亚型的区别。

3.一种用于环介导等温扩增检测牛呼吸系统疾病五种病原体8个基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1或2所示的引物组合。

4.根据权利要求1所述用于检测牛呼吸系统五种病原体IBRV、BRSV、BPIV 3a、BPIV3c、M.b、P.m特异基因的LAMP，其特征在于，除同时检测牛呼吸系统五种病原外，具有牛副流感病毒、牛多杀性巴氏杆菌的分型引物组，分别见表3与表4、表7与表8。

5.根据权利要求3所述一种用于检测牛呼吸系统疾病五种病原体基因的试剂盒，其特征在于，所述的引物组合物在环介导等温扩增方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4-8：4-8：2-3：2-3。

6.根据权利要求3所述的一种用于检测牛呼吸系统五种疾病五种病原体基因的试剂盒，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应条件为62-65℃，时间50min。

7.权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，源于发病或亚临床感染呼吸系统的同一临床样本六种病原微生物的基因检测试剂盒或芯片中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒或芯片的检测步骤如下：

⑴提取待测细菌或源于呼吸系统的待检样品中基因组DNA；

⑵以步骤(1)提取的基因为模板，采用上述引物组合物分别对IBRV的gB基因、BRSV的N基因、BPIV 3a和BPIV 3c的N基因、M.b的oppD/F基因、P.m的ompH、A型P.m的hyaC-hyaD、B型P.m的bcbD基因进行荧光环介导等温扩增。