[发明专利]一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用

说明书

本发明公开了一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用。该引物组合包括外引物对、内引物对以及环形引物对，主要是针对牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因、牛合胞体病毒的N基因、牛副流感病毒3型a基因型的N基因、牛副流感病毒3型c基因型的N基因、牛支原体的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌的ompH基因/A型hyaC‑hyaD基因/B型bcbD基因的8个特异基因，设计特异性的实时荧光环介导等温扩增引物组，借助实时荧光信号及溶解曲线判定结果，特异性强，灵敏度高，可同时用于上述五种病原体及不同血清型和基因亚型的检测，方便快捷，实用性强。

技术领域

本发明属于病原检测生物技术领域，涉及一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用。

背景技术

环境因素的改变、自身免疫力的下降或病原体的感染等多种原因均可能导致疾病的发生。随着我国进出口贸易和养牛业的快速发展，牛繁育规模化程度的显著提高，加上牛不断被调入转出，牛系统性疾病发生的危害性不仅日益严重，且更加复杂，以多种病毒、细菌混合感染为常见，而牛呼吸系统疾病是养牛业常见的疾病之一。呼吸系统疾病在世界范围内严重流行，病死率平均在10％左右，高达40％。引发牛呼吸系统疾病的病原主要包括牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型基因a和c型(BPIV-3aand BPIV-3c)、牛支原体(Mycoplasma bovis，M.b)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)等。

IBR呈世界性流行，在我国奶牛平均阳性率35.8％，甚至高达70％。BPIV多见于集约化饲养的奶牛和肉牛，呈亚临床感染；支原体、IBRV混合感染可加剧病情。支原体感染形成的牛呼吸道疾病死亡率高达50％以上，病情多发生于犊牛长途运输过程中。美国成牛的BRSV感染总发生率高达67％；加拿大牛养殖中BRSV感染的总发生率约为36％；瑞典牛奶中BRSV抗体出率最高可达到89％，而犊牛感染呼吸道合胞体病毒的概率相对较高，超过90％。牛多杀性巴氏杆菌感染，在流行期达98％以上，尤其犊牛在长途运输、突换饲料、气候骤变等情况下极易感染多杀性巴氏杆菌而发病。

鉴于牛呼吸系统疾病通常是多病原混合感染，多种病原的同时检测有利于快速获得诊断结果，以便于及早制定有效的预防与治疗措施。

病原分离是鉴定的金标准，但操作繁琐、耗时长、技术要求高和分离率低，对人员和实验条件要求高，同时还需要借助于血清学、生化鉴定，甚至分子生物学技术才能确定，是其缺点；血清学诊断方法虽然已被普遍使用，但是由于抗体产生速度较为缓慢，不适于在病原急性感染或早期感染阶段的使用。常规PCR方法的扩增结果需要借助于凝胶电泳的目的片段大小及序列测定分析来判断，灵敏度较低，耗时较长，较繁琐。多重实时荧光定量PCR虽然可实现同时检测多病原，也体现高特异性与高敏感性，快速、检测效率高的特点，但存在升温、变温等过程，耗时相对较长，对仪器多通道要求较高。荧光环介导恒温扩增LAMP具有灵敏度高、特异性好、反应时间短，各被检测病原的引物之间没有相互干扰，又集合荧光定量PCR的优点，通过溶解曲线和Tm值实现结果的判定，更有利于推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测牛呼吸系统疾病五种主要病毒和细菌荧光环介导恒温扩增技术的引物组合，用于检测源于牛呼吸系统疾病临床或亚临床样本中的牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型和c基因型、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A型和B型，及早发现病原，并对相关病原进行分型，有助于临床治疗、疫苗使用等防控措施的有效制定。

上述目的是通过以下技术方案实现的：