[发明专利]一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3-M3、ThAPT3-M4和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3‑M3、ThAPT3‑M4和应用。本发明以碱性蛋白酶PA3为亲本，通过定点突变，从而获得了热稳定性显著提高的蛋白酶突变体。亲本PA3在60℃条件下处理10min和20min后，剩余酶活分别为1.9％和1.6％。突变体ThAPT3‑M3和ThAPT3‑M4在60℃下处理10min后，剩余酶活分别为58％和68％；突变体ThAPT3‑M3和ThAPT3‑M4在60℃下处理20min后，剩余酶活分别为31％和45％。此外，突变体ThAPT3‑M4的比活力提高了25％。因此，本发明提供的碱性蛋白酶突变体相较于野生型有着更好的热稳定性和催化活性，具有更好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3-M3、ThAPT3-M4和应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶是重要的肽键水解酶类，目前已知的蛋白酶中1/3属于丝氨酸蛋白酶家族。枯草杆菌类蛋白酶家族又称为丝氨酸蛋白酶S8家族，为丝氨酸蛋白酶第二大家族。因此具有广泛的切割特异性和优异的有机溶剂稳定性，被广泛的应用于食品、皮革、医疗和饲料等各个工业领域。蛋白酶在酶制剂领域占有较高的市场份额。但是蛋白酶的热稳定性较差，目前工业上应用最广泛的商用蛋白酶Proteinase K在60℃下稳定性的表现也差强人意。因此碱性蛋白酶在高温环境下的稳定性是限制其进一步工业应用的主要瓶颈。

蛋白质工程是目前优化蛋白酶酶学性质的最有效手段之一，通过区段替换或定点突变的理性设计方法可以高效地提高蛋白酶的稳定性及催化活性。

发明内容

本发明的目的是提供以Torrubiella hemipterigena来源的碱性蛋白酶PA3为亲本获得的热稳定性和比活力提高的突变体ThAPT3-M3和ThAPT3-M4。

本发明的再一目的是提供上述碱性蛋白酶蛋白酶突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述碱性蛋白酶突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述碱性蛋白酶突变体基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供制备热稳定性提高的碱性蛋白酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述蛋白酶突变体的应用。

本发明以Torrubiella hemipterigena来源的碱性蛋白酶PA3为亲本进行突变，得到热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体，其中，PA3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。(下划线标注为前导肽对应氨基酸序列)

SEQ ID NO:1：

APSLARREEPAPLLEARGAQAIPGKFIVKLREGSPLAALQQAMSLLGGKADHVFQNVFSGFAASMNPAVIELMRNHPDVEYIEQDGKVNINAYTTQTGAPWGLGRISHRAKGSTSYTYDTSAGEGTCVYVIDTGVEDTHPEFEGRAKLIKTYYGNRDGHGHGTHCSGTIGSKTYGVAKKTKIYGVKVLDDNGSGTFSNIIAGVDFVANDYKTRGCPKGAVASMSLGGGKTQAVNDAVARLQRAGVFVAVAAGNDNTDAANTSPASEPSVCTVGASDKDDVRSTFSNYGSVVDIFAPGTAILSTWIGGRTNTISGTSMATPHIAGLAAYLMGKDGAVAAGLCAKIAQTATRNVLRNIPAGTINALAFNGNPSG*。