[发明专利]柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库及构建方法

权利要求书

1.柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：

S1：质粒pLN2-Trans和pLLN2-Trans的构建：

（1）构建pLN2-Trans，在pN2-Trans中转座酶内连接乳糖启动子Plac获得pLN2-Trans；

（2）构建pLLN2-Trans，在步骤（1）获得的pLN2-Trans中的转座酶5’端连接Plac；

S2：基于质粒pLN2-Trans和pLLN2-Trans的转座子突变体文库的构建方法，步骤如下：

（1） 制备黄单胞菌感受态细胞；

（2）将步骤（1）获得黄单胞菌感受态细胞分别加入到质粒pLN2-Trans和pLLN2-Trans中混合，体积均为90:2，通过电击将质粒导入黄单胞菌中；使用额外添加了质量分数为1 %蔗糖的NB液体培养基培育，使用添加50 μg/ml 卡那霉素的NB固体培养基筛选，分别获得转座子pLN2-Trans和pLLN2-Trans成功转化的黄单胞菌；

（3）将步骤（2）获得的转座子pLN2-Trans成功转化的黄单胞菌和转座子pLLN2-Trans成功转化的黄单胞菌分别刮板，然后分别将获得的黄单胞菌体加入到添加50 μg/ml 卡那霉素的NB液体培养基中，分别获得转化pLN2-Trans和pLLN2-Trans的突变体库，分别命名为T1和T2；将突变体文库均匀分装后全部保存于-80 ℃冷藏；

所述S1 步骤（1）使用引物扩增pBBR1MCS-2载体中LacZ基因上游270bp的核苷酸序列，获得驱动基因表达的乳糖启动子；使用无缝克隆组装法将乳糖启动子替换已知载体pMCS2-transposase中的转座酶自身启动子片段，得到用于构建转座子插入突变体库的载体pLN2-Trans；

所述S1 步骤（2）中使用NdeI 和KpnI双酶切处理pLN2-Trans获得线性化载体；使用引物扩增pBBR1MCS-2载体中LacZ基因上游270bp的核苷酸序列；使用无缝克隆组装法将启动子片段连接至线性化的载体中，获得用于构建转座子插入突变体库的载体pLLN2-Trans。

2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述S2 步骤（1）中准备单菌落培养获得的黄单胞菌菌液，离心后使用无菌水重悬；使用预冷的10 %甘油多次洗涤细胞获得黄单胞菌感受态细胞。

3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述S2 步骤（2）中将S2步骤（1）获得黄单胞菌感受态细胞分别加入到质粒pLN2-Trans和pLLN2-Trans中混合后，通过30次电击将转座子载体导入黄单胞菌中；使用添加质量分数为1 %蔗糖的NB液体培养基培育，静置于30 ℃培养箱孵育3 h；随后铺板于添加50 μg/ml 卡那霉素的NB固体培养基上，30℃倒置培养2 d；分别获得转座子pLN2-Trans和pLLN2-Trans成功转化的黄单胞菌。

4.一种测序文库的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

利用如权利要求1-3任一项所述柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库的构建方法获得柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库，然后对柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库用添加50 μg/ml 卡那霉素的NB液体培养基进行扩大培养，使用CTAB法提取黄单胞菌基因组DNA，使用限制性内切酶NcoⅠ、EcoRI、BamHI、SphI、MfeI、MluI、NotI消化处理基因组DNA，用100 %乙醇重新沉淀提取DNA，然后加入T4连接酶自连，使用胶回收试剂盒进行DNA纯化；再使用内切酶特异性引物进行反向PCR获得载体转座子侧翼基因组序列片段，PCR的条件为：98℃3min，98℃ 10s，58℃ 15s，72℃ 2 min，33个循环，72℃ 10 min，12℃保温；随后再次使用胶回收试剂盒进行DNA纯化，即得测序文库。

5.如权利要求4所述制备方法获得的测序文库的数据处理方法，其特征在于，数据处理的方法如下：

在Window10系统电脑中安装Ubuntu，构建Linux子系统；使用fastp软件对原始测序数据进行质控；使用seqkit软件去重复序列，并以载体转座子末端序列进行单向特异性筛选；通过要求25 bp O-end端序列或I-end端序列完全匹配，筛选获得T1读出序列；分别进行正向和反向筛选后，将反向序列颠倒后合并；使用基于bwa的TPP软件识别O-end端序列，将结果映射到黄单胞菌全基因组上，得到插入位点；对插入位点的数据提取后进行筛选以删除测序的序列和基因组序列不完全匹配的情况，提取有效数据进行后续分析。