[发明专利]柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库及构建方法

说明书

本发明涉及柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库及构建方法，属于生物产业技术领域。构建方法的步骤为：S1：质粒pLN2‑Trans和pLLN2‑Trans的构建；S2：基于质粒pLN2‑Trans和pLLN2‑Trans的转座子突变体文库的构建：（1）制备黄单胞菌感受态细胞；（2）转座子pLN2‑Trans和pLLN2‑Trans成功转化的黄单胞菌的制备；（3）转化pLN2‑Trans和pLLN2‑Trans的突变体库T1和T2的制备。本发明实现了高效的扩增转座子及其侧翼区域的扩增，并通过高通量测序鉴定柑橘溃疡病菌必需基因。

技术领域

本发明涉及生物产业技术领域，具体涉及柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库及构建方法。

背景技术

柑橘溃疡病是一种严重威胁柑橘种产量和质量的植物病害，其是由柑橘黄单胞菌柑橘亚种引起的细菌性病害，柑橘溃疡病发病轻则造成柑橘果实、叶片带有病疤；重则造成果实落果，幼树落叶，导致农民减收。

黄单胞菌通过柑橘叶片或果实表面的气孔或伤口侵入，在侵染成功并大量繁殖后借助喷发性脓疱向外逸散，从而开始下一轮侵染周期。目前对于柑橘溃疡病的防治尚未有完善的方法，生产中一般通过喷施铜制剂或砍除病树进行病害防控，但产生环境及抗药性问题。本发明利用转座子突变结合高通量测序技术鉴定柑橘溃疡病菌必需基因，有望为病害防治发掘新的药物靶标。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库及构建方法，具体通过构建柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库并运用高通量测序技术鉴定其必需基因的方法，用于柑橘黄单胞菌柑橘亚种引起的细菌性柑橘溃疡病的研究与防治。本发明实现了高效的扩增转座子及其侧翼区域的扩增，从而大大降低了制备测序文库的成本，同时由于反向PCR扩增片段可由PCR程序决定，侧翼序列也较长，比对结果更准确。

本发明的技术方案如下：

柑橘溃疡病菌高饱和转座子突变体库的构建方法，步骤如下：

S1：质粒pLN2-Trans和pLLN2-Trans的构建：

（1）构建pLN2-Trans，在pN2-Trans中转座酶内连接乳糖启动子Plac获得pLN2-Trans；

优选的，使用引物扩增pBBR1MCS-2载体中LacZ基因上游270bp的核苷酸序列，获得驱动基因表达的乳糖启动子；使用无缝克隆组装法将乳糖启动子替换已知载体pMCS2-transposase中的转座酶自身启动子片段，得到用于构建转座子插入突变体库的载体pLN2-Trans；

（2）构建pLLN2-Trans，在步骤（1）获得的pLN2-Trans中的转座酶5’端连接Plac；

优选的，使用NdeI 和KpnI双酶切处理pLN2-Trans获得线性化载体；使用引物扩增pBBR1MCS-2载体中LacZ基因上游270bp的核苷酸序列；使用无缝克隆组装法将启动子片段连接至线性化的载体中，获得用于构建转座子插入突变体库的载体pLLN2-Trans。

S2：基于质粒pLN2-Trans和pLLN2-Trans的转座子突变体文库的构建方法，步骤如下：

（1）制备黄单胞菌感受态细胞；

优选的，准备单菌落培养获得的黄单胞菌菌液，离心后使用无菌水重悬。使用预冷的10 %甘油多次洗涤细胞获得黄单胞菌感受态细胞。

（2）将步骤（1）获得黄单胞菌感受态细胞分别加入到质粒pLN2-Trans和pLLN2-Trans中混合，体积均为90:2，通过电击将质粒导入黄单胞菌中；使用额外添加了质量分数为1 %蔗糖的NB液体培养基培育，使用添加50 μg/ml 卡那霉素的NB固体培养基筛选，分别获得转座子pLN2-Trans和pLLN2-Trans成功转化的黄单胞菌；