[发明专利]利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法

说明书

本发明公开了一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，属于生物技术组织培养领域。本发明以小檗科十大功劳属植物细叶十大功劳(Mahonia fortunei(Lindl.)Fedde)植株，尤其是幼嫩的叶片作为外植体开展组织培养研究，直至外植体边缘产生愈伤组织或完全愈伤化，但未褐化时终止。收集培养得到的愈伤组织，采用高效液相色谱(HPLC)法测定所得愈伤组织中各生物碱的含量，结果显示非洲防己碱、药根碱、巴马汀、小檗碱及其生物合成途径中多种生物碱的含量(干重百分比)相比原外植体有显著增加，能够实现细叶十大功劳生物合成途径中多种难以采用化学合成获得的微量生物碱的有效富集，为产业化生产提供了有益方法。

技术领域

本发明属于生物技术组织培养领域，具体涉及一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法。

背景技术

自然界丰富的植物资源蕴涵着数量可观的具有显著药理活性的次生代谢产物，除了利用植物材料通过提取分离的方法，以及采用化学合成方法获得这些化合物以外，利用生物技术定向生产高活性次生代谢产物也是解决中药资源短缺的有效方法之一。

细叶十大功劳(Mahonia fortunei(Lindl.)Fedde)为小檗科十大功劳属植物，又名狭叶十大功劳、黄天竹、土黄柏、猫儿刺、土黄连、八角刺、刺黄柏、猫儿头、刺黄芩、功劳木，十大功劳、山黄芩、西风竹、刺黄连等，是中药功劳木的主要基源植物之一。细叶十大功劳的根、茎、叶中含有小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等多种异喹啉型生物碱，具有抑菌、降压、降血脂、降血糖等药理作用。近年来的文献报道了这些生物碱在治疗细菌和病毒感染、恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、脑缺血性损伤、精神疾病、阿尔茨海默病(Alzheimerdisease)、骨质疏松等多方面的临床应用，显示出该类生物碱广泛的临床应用及开发价值。

然而小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱在细叶十大功劳及其它药用植物中的含量较低，尤其是药根碱及其生物合成途径中生成的多个中间体化合物(多为生物碱类)含量更低，且针对这些化合物目前也缺乏成熟的化学合成方法，常用的以黄连为药材采用提取方法制备这些生物碱的成本也很高，限制了上述生物碱类化合物的进一步研究及开发。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，并提供一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，能够实现细叶十大功劳生物合成途径中多种难以采用化学合成获得的生物碱的有效富集，极大地降低了小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其生物合成途径中各生物碱产业化生产的成本。

本发明所采用的具体技术方案如下：

一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其以细叶十大功劳植株部位作为外植体，将外植体进行消毒后表面贴于添加蔗糖、琼脂、2,4-对氯苯氧乙酸和6-糖基氨基嘌呤的MS培养基上，先避光密闭培养后再交替采用光照培养和黑暗培养，培养到外植体边缘产生愈伤组织至外植体完全愈伤化但尚未褐化期间的任意时刻终止，采集培养得到的含愈伤组织的外植体或者愈伤组织并从中提取小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其他生物碱。

作为优选，培养外植体所用的每升培养基中，含有2.37-9.58g MS培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.25-1.5mg 2，4-对氯苯氧乙酸、0.25-1.5mg 6-糖基氨基嘌呤，且培养基的pH调至5.8，灭菌后使用。

作为优选，所述外植体采用细叶十大功劳的茎、叶或根。

作为优选，所述外植体优选采用细叶十大功劳的叶部分。

作为优选，所述外植体进一步优选采用细叶十大功劳幼嫩的叶片。

作为优选，所述消毒过程为：将所述外植体先用蒸馏水冲洗5～10分钟，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3～4次、75％酒精洗涤20～30秒、1％～10％次氯酸钠溶液漂洗3～8分钟，再用无菌水洗涤3～4次。