[发明专利]一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中的引物分别为BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R，所述BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27-28和SEQ ID NO.53-54所示，所述引物探针组合中的探针为BNoV-P和BRV-P，所述BNoV-P和BRV-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59-60所示。

2.根据权利要求1所述的同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述BNoV-F、BNoV-R是以牛诺如病毒的RdRp基因作为模板设计得到，所述BRV-F、BRV-R是以牛轮状病毒的VP7基因作为模板设计得到；

所述BNoV-R和BRV-R的5’端进行生物素修饰；所述BNoV-P的5’端进行生物素修饰，第30位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰；所述BRV-P的5’端进行生物素修饰，第31位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰。

3.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA基础检测试剂盒，其特征在于，包括基础磷酸盐缓冲溶液、乙酸镁溶液、纯化水以及如权利要求1或2所述的引物探针组合。

4.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA-LFD检测试剂盒，其特征在于，包括反应复合缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、酶混合液、乙酸镁溶液以及如权利要求1或2所述的引物探针组合。

5.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的侧流层析试纸条，其特征在于，所述侧流层析试纸条用于检测如权利要求4所述RAA-LFD检测试剂盒扩增得到的产物，所述侧流层析试纸条包括：样品垫、检测线和质控线，其中，所述检测线进一步包括T1检测线和T2检测线；

所述样品垫含有抗FAM的鼠源单抗，所述T1检测线上标记有链霉亲和素，T2检测线上标记有抗罗丹明的抗体，所述质控线含有羊抗鼠抗体，并将抗FAM单克隆抗体用作标记胶体金。

6.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待检样品的RNA，将如权利要求1或2所述的引物探针组合与所述待检样品的RNA混合，配置RAA反应体系，并在39℃温度条件下扩增反应15-30min，得到扩增产物；

取扩增产物10μL，加入到90μL的ddH₂O进行稀释后滴加到如权利要求5所述侧流层析试纸条的样品垫末端，反应5min即可读取结果，根据结果判断所述待检样品中是否含有牛诺如病毒和/或牛轮状病毒。

7.根据权利要求6所述的同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，其特征在于，所述BNoV-R标记罗丹明，所述BRV-R标记生物素；

所述RAA反应体系为：

反应复合缓冲液23.5μL、dNTPs(25mM)0.6μL、BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R各1μL、BNoV-P 0.3μL、BRV-F和标记生物素的BRV-R各2μL、BRV-P 0.6μL、酶混合液12.6μL、乙酸镁溶液2.5μL、待检样品的RNA 3.8μL，总体积50μL。

8.根据权利要求6所述的同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，其特征在于，所述BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R的浓度为200nM，所述BNoV-P的浓度为60nM；所述BRV-F和标记生物素的BRV-R的浓度为400nM，所述BRV-P的浓度为120nM。