[发明专利]一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明提出一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，属于生物技术领域，能够解决现有技术中尚无同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA‑LFD方法的技术问题。该引物探针组合中的引物分别为BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R，BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27‑28和SEQ ID NO.53‑54所示，所述引物探针组合中的探针为BNoV‑P和BRV‑P，所述BNoV‑P和BRV‑P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59‑60所示。本发明能够从导致犊牛腹泻的病毒中快速、准确地检测出牛诺如病毒和牛轮状病毒，在39℃较低反应温度下反应时间仅需30min，试纸条结果仅需5min即可完成检测。本发明能够应用于基层现场牛诺如病毒和牛轮状病毒的可视化检测方面。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术

新生犊牛腹泻(Neonatalcalfdiar-rhea，NCD)是断奶前造成犊牛死亡的主要原因之一。肠道病原感染是造成犊牛腹泻的主要原因，而牛诺如病毒(Bovine Norovirus，BNoV)和牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)是引起犊牛腹泻较常见的病原。其中，诺如病毒(Norovirus，NoV)属于杯装病毒科诺如病毒属，为无囊膜的、单正链RNA病毒，直径27～35nm，正20面体结构，病毒衣壳由90个主要衣壳蛋白的二聚体和1～2个次要结构蛋白组成。BNoV属于GIII型的NoV，BNoV全基因组长约为7.3kb，除鼠诺如病毒(MN oV)外都包含3个开放阅读框(ORF)。犊牛感染BNoV后主要表现为非出血性肠炎、轻度腹泻，腹泻可持续3～4天、短暂性厌食以及木糖吸收不良等症状。其中，3周大的牛比新生犊牛感染BNoV更严重。牛轮状病毒(Bovin e rotavirus，BRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属的无囊膜的、双股RNA病毒，形似车轮的粒子，完整的病毒粒子呈二十面体，直径约65～75nm，外缘光滑。BRV感染主要发生在犊牛，患病犊牛早期表现为精神沉郁、食欲减退、流诞、不愿站立，随后出现严重的厌食和腹泻。此外，BNoV和BRV两者还会发生混合感染，会加重犊牛腹泻的程度，最终会导致生产性能和免疫力低下，饲养以及治疗成本增加，严重制约养牛场的良种选育和扩繁，给养牛业带来了巨大的经济损失。

由于上述两种病毒普遍存在，使得对该病的快速、准确的检测显得尤为重要，及时检出病原，实施针对性治疗方案，挽回财产的损失，故在生产实践中急需要建立适用于基层病原快速检测的方法。目前，常用的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、RT-PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术以及环介导等温扩增技术(LAMP)等，但这几种方法各有优缺点。其中，RT-PCR和荧光定量PCR灵敏度较高，但流程复杂、耗费时间长、成本高、仅限于实验室操作；LAMP技术无需复杂的仪器，适用于现场检测，但引物设计复杂、严苛，且开盖后容易形成气溶胶污染，假阳性问题较严重。

重组酶介导扩增技术(Recombinase-aided amplification，RAA)是一种新型的体外等温核酸扩增技术。37℃恒温下可实现核酸扩增产物的指数增长，不需要高温热变性，一般25min内即能完成扩增反应。目前该技术已经应用于多种病毒和细菌检测。RAA技术可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号和侧流层析试纸条等不同的方式对RAA结果进行监测。但是，目前还没有双重RAA-LFD法同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒，双重RAA-LFD检测方法能及时快速的检测出牛诺如病毒、牛轮状病毒或二者的混合感染，适用于基层牛场的疾病诊断。

发明内容

本发明针对上述的现有技术中尚无同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD方法的技术问题，提出一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，通过建立一种双重RAA-LFD技术能同时检测牛诺如病毒、牛轮状病毒或二者的混合感染，以实现对基层养殖环境中对相关病原进行快速、准确的检测。