[发明专利]一种高产L-2-氨基丁酸的无质粒基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种高产L‑2‑氨基丁酸的无质粒基因工程菌及其应用。本发明提供的产L‑2‑氨基丁酸的无质粒基因工程菌，以Escherichia coli THR为底盘细胞经代谢工程和基因编辑技术改造得到，该基因工程菌菌株能以葡萄糖为原料，通过发酵培养得到L‑2‑氨基丁酸，在无质粒增加外源酶活的情况下，5L发酵罐分批补料发酵产量达到13.81g/L，发酵成本低，产物浓度高，没有副产物影响，产物易于纯化，适用于工业应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产L-2-氨基丁酸的无质粒基因工程菌及其应用。

背景技术

L-2-氨基丁酸(L-2-Aminobutyric acid，简称L-ABA)是一种非天然的手性α-氨基酸，作为关键手性中间体可被用于合成多种手性药物，如结核病治疗药物乙胺丁醇，以及抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦。

L-2-氨基丁酸分子式C₄H₉NO₂，相对分子量为103.12，熔点270-280℃，25℃下每100g水中可溶解22.7g，微溶于乙醇、乙醚等，等电点为6.05(25℃)，无臭、微甜的白色片状晶体。L-2-氨基丁酸结构式如下式所示：

目前L-2-氨基丁酸主要通过化学法来实现工业化合成，但面临反应条件苛刻、环境不友好等不足。

为避免化学法合成L-2-氨基丁酸产生的问题，因此，近年来已开发出诸多L-2-氨基丁酸的生物合成途径，主要通过脱氢酶或者转氨酶等酶催化法来进行制备。采用酮酸和谷氨酸作为底物，在转氨酶作用下生成L-2-氨基丁酸，但该法收率低；以L-苏氨酸为原料，采用含有氨基酸脱氢酶的三酶体系一锅法来制备L-2-氨基丁酸，虽然添加了辅酶循环系统，但还是需要适量的辅酶，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD⁺或NADH等的参与，由于辅酶价格昂贵，限制了其在工业水平的应用，且有副产物影响产品的纯化；氨基酸氧化酶法是使用D-氨基酸氧化酶在金属催化剂的作用下对混旋底物进行拆分制备L-2-氨基丁酸，该法成本高，不适合大规模工业应用。此外还有氨基酰化酶法等，但是存在生产成本过高以及酶活受到底物抑制的问题，因此工业应用效果不佳。

因此，本研究团队拟开发出一种新的生物合成法进行L-2-氨基丁酸的合成，以避免化学合成反应条件苛刻等问题，同时避免现有生物合成法成本高、产量低的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高产L-2-氨基丁酸的无质粒基因工程菌及其应用。本发明的目的在于通过代谢工程和基因编辑技术改造大肠杆菌以获得高产L-2-氨基丁酸的重组大肠杆菌菌株，具体地，本发明的目的在于以本研究团队构建的Escherichia coli THR为底盘细胞，提供一种高产L-2-氨基丁酸的无质粒基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-2-氨基丁酸中的应用。

本发明的具体技术方案为：

一方面，本发明提供了一种高产L-2-氨基丁酸的无质粒基因工程菌，由以下方法构建而成：(1)以E.coli THR为底盘菌，将菌株E.coli THR基因组中的ptsG基因用ilvA*基因及leuDH基因替换，得到重组菌株E.coli THR△ptsG::ilvA*-leuDH，记为ABA-1；

(2)将菌株E.coli THR△ptsG::ilvA*-leuDH接种到2-酮丁酸液体培养基中进行传代培养，筛选能在2-酮丁酸浓度不低于50g/L的液体培养基中正常生长的菌株，得到菌株E.coli THR△ptsG::ilvA*-leuDHMut，记为ABA-2；

(3)将菌株E.coli THR△ptsG::ilvA*-leuDHMut基因组中相邻的ltaE基因及poxB基因用leuDH基因替换，得到重组菌株E.coli THR△ptsG::ilvA*-leuDHMut△ltaE△poxB::leuDH，记为ABA-3；