[发明专利]对有毒蘑菇种类进行常规/实时荧光/数字PCR鉴定的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种对有毒蘑菇进行PCR鉴定的试剂盒，其特征在于：包括用于对有毒蘑菇进行PCR分子鉴定的特异性引物，

所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；

所述有毒蘑菇对应的特异性引物如下表所列：

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括用于实时荧光PCR的特异性TaqMan探针，每种有毒蘑菇对应的TaqMan探针如下表所示：

。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR扩增反应所需的试剂；优选所述PCR为常规PCR或者实时荧光PCR或者数字PCR；优选所述PCR扩增反应所需的试剂为DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照。

5.一种对有毒蘑菇种类进行常规PCR鉴定的方法，其特征在于，所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；

包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用权利要求1所述的试剂盒中的特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有对应目的扩增片段的样品鉴定为相应种类的有毒蘑菇；

假褐云斑鹅膏对应的扩增片段大小为380bp，

锥鳞白鹅膏对应的扩增片段大小为190bp，

新苦粉孢牛肝菌对应的扩增片段大小为240bp。

6.根据权利要求5所述的常规PCR鉴定的方法，其特征在于：

PCR反应体系为：总体积25μL，含有：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，浓度均为10μM的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，余量为ddH₂O；

假褐云斑鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；

锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35循环；72℃10min；

新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；

优选所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带；

优选地，可检测的模板浓度可低至10^-5ng/μl。

7.一种对有毒蘑菇种类进行实时荧光PCR鉴定的方法，其特征在于，所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；

包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用权利要求2所述的试剂盒对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否为对应种类的有毒蘑菇，如果Ct≤30则判断为对应种类的有毒蘑菇阳性。

8.根据权利要求7所述的实时荧光PCR鉴定的方法，其特征在于：

所述实时荧光PCR的反应体系为：总体系20μL，含有2×Premix Ex Taq 10μl，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μl，浓度为10μmol/L的探针0.5μl，ddH₂O 6.5μl，DNA模板1μl；

qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40个循环；

优选地，可检测的模板浓度可低至10^-5ng/μl。