[发明专利]人类DNA样本定量扩增体系及其应用

说明书

本发明公开了人类DNA样本定量扩增体系及其应用，所述扩增体系包括特异性扩增以下4个靶序列的引物和探针复合物；其中，4个靶序列为：2个常染色体靶基因CSF1PO和TPOX、1个Y染色体靶基因SRY、1个非人源合成寡核苷酸IPC。优点在于：(1)本发明所述扩增体系及其试剂盒可应用于所有法医DNA分析，可单管同时扩增四个不同靶基因，对人类总DNA和人类男性DNA进行定量和定性评估，提供有关样品降解和抑制剂情况等信息。所设引物探针特异性强，灵敏度高，最低检测限可以达到1pg水平。(2)所述试剂盒有效简化了qPCR反应操作的步骤，提高了测试的准确度和精密度，且适用于法医DNA分析中所有采集的样品来源。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及法医DNA分析技术，具体为人类DNA样本定量扩增体系及其应用。

背景技术

高纯度的DNA样本是获得高质量测序产出结果的前提，在高效的DNA提取方法基础上，对提取后的DNA样本进行定量分析十分必要。

法医样本类型纷繁复杂，具有挑战性的样本通常包括微量或痕量样本、高度降解的DNA样本、混合样本以及抑制样本。以上样本因素可能会导致无法继续进行STR分析，如无法确定使用哪种STR试剂盒或无法确定进行STR分析的样本使用量。因此，需要一种可靠、灵敏、快速的方法来评估DNA提取物。

DNA定量最本质的目的是估计可扩增的DNA量。由于法医样品中存在的DNA的相对量差异很大，需要具有宽动态范围的定量方法。此外，由于DNA检测所使用的PCR技术灵敏度高，最佳的定量方法也应该是非常灵敏的。实时定量PCR的动态范围高达五个数量级，是目前满足以上两个条件的首选方法。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明采用TaqMan实时荧光定量PCR技术，可同时定量样本中的人类总DNA和人类男性DNA，并评估样本DNA降解和提取后PCR抑制剂残留情况。使用本试剂盒获得的结果有助于在STR分析工作流程中做出关键决策，极大提高实验效率并更加谨慎地使用珍贵的样本。

技术方案：人类DNA样本定量扩增体系，所述扩增体系包括特异性扩增以下4个靶序列的引物和探针复合物；其中，4个靶序列为：2个常染色体靶基因CSF1PO(GenBank:AC011382.4)和TPOX(GenBank:AC105450.1)、1个Y染色体靶基因SRY(GenBank:AP023484.1)、1个非人源合成寡核苷酸IPC。

优选的，所述非人源合成寡核苷酸IPC为人工改造的克隆质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示：

CGCCACGGTCACGGAGCACGAGAAATTCCACTTTACCCACCGTGAACGCCGTAATCATTGGATCTACTTTCCTTCTACGCCAAGTAAATCAATTGTTTGCTTCAACCATCATTTCGGCTTTGAACGTGCCGCTTGATACTGACA。

优选的，所述引物和探针复合物的序列分别为：CSF1PO基因的引物序列为SEQ IDNO:1-2，探针序列为SEQ ID NO:3；TPOX基因的引物序列为SEQ ID NO:4-5，探针序列为SEQID NO:6；SRY基因的引物序列为SEQ ID NO:7-8，探针序列为SEQ ID NO:9；IPC寡核苷酸的引物序列为SEQ ID NO:10-11，探针序列为SEQ ID NO:12。

优选的，所述引物和探针复合物的终浓度为：SEQ ID NO:1-2为0.4μM，SEQ ID NO:3为0.16μM；SEQ ID NO:4-5为0.24μM，SEQ ID NO:6为0.1μM；SEQ ID NO:7-8为0.3μM，SEQID NO:9为0.12μM；SEQ ID NO:10-11为0.2μM，SEQ ID NO:12为0.1μM。具体的引物探针序列和浓度如表1所示：

表1引物探针序列和对应浓度