[发明专利]乳腺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用

权利要求书

1.乳腺癌相关基因扩增子文库的制备方法，其特征在于，使用多重PCR方法对样本中的乳腺癌相关基因进行扩增，而后仅经过一步纯化获得扩增子文库；

所述多重PCR使用的引物对包括如下上游引物和下游引物：

上游引物的核苷酸序列从5’端至3’端依次为：5’-正向接头序列-标签序列1-正向测序引物序列-乳腺癌相关基因扩增的特异性正向引物序列-3’；

下游引物的核苷酸序列从5’端至3’端依次为：5’-反向接头序列-标签序列2-反向测序引物序列-乳腺癌相关基因扩增的特异性反向引物序列-3’；

所述标签序列1和标签序列2为互相不同的6～10bp的核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正向接头序列如SEQ ID No：1所示；所述反向接头序列如SEQ ID No：2所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正向测序引物序列如SEQ ID No：3所示；所述反向测序引物序列如SEQ ID No：4所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述上游引物和/或下游引物的5’端具有磷酸化修饰。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，同一样本的乳腺癌相关基因的数量≥1；

优选地，同一样本中乳腺癌相关基因的数量＞1，不同乳腺癌相关基因所使用的上游引物和下游引物具有相同的标签序列组合。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，不同样本所使用的上游引物和下游引物具有不同的标签序列组合。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述样本包括来源于全血、血浆、唾液、组织、福尔马林固定样本、石蜡包埋样本或穿刺样本中的DNA样本或RNA样本。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多重PCR反应程序依次包括：

98℃下反应5min循环1次；

98℃下反应10s，60℃下反应15s，72℃下反应20s，并循环30次；

72℃下反应5min，循环1次；

4℃下保温，循环1次；

所述多重PCR反应的体系包括，PCR反应预混液、引物混合物、DNA模板和无酶水。