[发明专利]乳腺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用

说明书

本发明涉及高通量测序技术领域，尤其是涉及乳腺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用。(1)本发明能够通过一步多重PCR和一步产物磁珠纯化步骤即可完成乳腺癌相关基因文库制备，大大缩短了高通量测序文库的操作步骤和实验时间。由于不需要使用更多的PCR和纯化试剂，可以更大地降低实验成本。在减少PCR和磁珠纯化步骤的同时，降低了实验过程中样本多次加样和多次纯化带来的气溶胶污染，可以提高检测结果的准确性。(2)本发明含有双端标签序列，可以比只有单端标签序列的文库进行更严格的数据拆分质控，从而能降低拆分样本的数据污染，提高数据质控的准确性。(3)本发明制备的文库含有5’端磷酸化修饰，可不通过文库接头转换试剂，就能兼容用于下游的Illumina和华大测序平台上机测序，具有更多的仪器型号拓展适配性。综上来看，本发明具有操作简便、成本更低、时间更快、适用平台更广泛和文库污染率更低等效果。

本发明为分案申请，母案申请号为2022115394195，主题名称为高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用，申请日为2022年12月02日。

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，尤其是涉及乳腺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用。

背景技术

高通量测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术由于可以对样本进行高通量、并行大规模测序，相比传统的一代测序、qPCR等技术，可以同时对更多基因组区域进行研究，且灵敏度更高、成本更低。扩增子测序(Amplicon Sequencing)方法是测序文库制备的一种，相比常规的杂交捕获文库则不需要经过基因组片段化、末端修复、3’加A尾、连接接头、探针杂交捕获、目标区域富集和产物纯化等繁琐的过程。研究者可以通过更短的时间、更低的成本，只对需要研究的基因区域进行扩增，即可获得目标区域文库产物，进行快速的高通量测序。

杂交捕获文库制备的原理是人工设计探针(DNA探针或者RNA探针)，探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合，探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性(一般是调节pH值到碱性)将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。优点：捕获区段大，可以达到几百MB，远超PCR方案和MIP方案，同时根据探针的原理其均一性很好，均一性是评价捕获技术很关键的参数，均一性好后续测序成本就会下降。缺点：容易捕获非目标片段，造成成本增加。因为杂交前样本会被随机打断一般认为500bp是比较合适的长度，探针捕获时可能和目标片段部分杂交，导致一些含有部分目标区段的片段被捕获。所以杂交捕获的特异性较差，容易捕获非目标区段。

扩增子靶向测序技术，又称多重PCR靶向测序技术，是一种将多重PCR技术与二代测序技术相结合的一种靶向捕获测序技术。该技术首先利用多重PCR反应，同时扩增多个目标区域序列，得到扩增子产物，然后通过PCR反应或者酶连接反应，将二代测序所需的接头序列引入到扩增子产物的两侧，得到扩增子文库，然后进行二代测序和生信流程分析，获取目标区域的序列信息，实现目标区域序列检测的目的。其特点是目的明确、应用灵活、价格低廉、分析简单，利用超高的测序深度，能检测全基因组、外显子组测序所不能涵盖的超低频突变，广泛应用于大健康筛查、医学诊断、分子育种、法医等领域。

常见的操作流程是：第一步以1～100ng DNA为模板，利用多重PCR扩增感兴趣的目标区域并构建扩增子，第二步，对产物进行纯化以及混合产物，为接头连接做好准备，第三步通过通用引物扩增，把完整的测序接头带上，再进行纯化。

目前的扩增子测序在文库制备时，通常先经过第一轮的多重PCR把目标区域扩增出来，经过产物的纯化后，再以纯化后的产物作为模板进行第二轮的PCR扩增，把测序的接头及标签序列加在文库序列的两端，然后再经过一次产物纯化后才能进行质检后上机测序。该流程存在实验步骤较多、操作时间较长、容易引入样本交叉污染等缺陷。