[发明专利]一种斑马鱼心肌特异表达钙离子信号指示探针品系的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种斑马鱼心肌特异表达钙离子信号指示探针品系的构建方法，所述方法包括：

S1、构建重组质粒myl7:GCaMP6s-CAAX，具体的，以转座载体pTol2为骨架，将myl7-GCamp6s片段插入其中获得；

S2、将上述重组质粒myl7:GCaMP6s-CAAX与Tol2转座酶mRNA转入斑马鱼胚胎，筛选并鉴定得稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为斑马鱼心肌特异表达钙离子指示探针品系。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，

GCamp6s基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

myl7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述重组质粒myl7:GCaMP6s-CAAX的核苷酸序列如SEQ.ID NO 3所示。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，筛选并鉴定的具体方法包括：

利用荧光显微镜斑马鱼胚胎进行筛选，在胚胎内表达绿色荧光蛋白的个体被认定为疑似F0个体，饲养疑似F0个体至具备繁殖能力，并将具备繁殖能力的F0代个体与野生型个体进行交配，获得F1代个体；利用荧光显微镜对F1代个体进行筛选，筛选出在心肌细胞内表达绿色荧光蛋白的个体，确定F1代阳性个体，并通过western blot鉴定GCaMP6s基因是否插入到F1代阳性个体基因组中，以便得到稳定遗传的转基因斑马鱼品系。

4.权利要求1-3任一项所述构建方法在斑马鱼钙成像分析及钙离子浓度监测中的应用。

5.一种斑马鱼心肌组织钙成像分析及钙离子浓度监测的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、将携带有GCaMP6s和DsRed表达的斑马鱼(Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS))胚胎首先置于2,3-丁烷二酮一肟溶液中，然后再摆放入甲基纤维素中；

S2、选择特定激发激光波长并设定延时成像条件参数，对步骤S1处理后的斑马鱼胚胎的心脏区域进行延时成像；

S3、对上述携带有GCaMP6s和DsRed表达的斑马鱼胚胎心脏处Ca²⁺浓度进行定量分析。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述携带有GCaMP6s和DsRed表达的斑马鱼(Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS))胚胎通过如下方法获得：

将权利要求1-3任一项所述构建方法获得的Tg(myl7:GCaMP6s)与Tg(myl7:DsRed2-NLS)的成年鱼系经交配后获得受精卵，所述受精卵发育至3-4dpf时，在体视荧光显微镜下挑选出携带GCaMP6s和DsRed表达的斑马鱼胚胎至4dpf时进行成像。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，

分别使用488nm和561nm的激光分别激发位于斑马鱼胚胎心肌细胞的GCaMP6s和位于心肌细胞核DsRed；

延时成像条件参数包括：选择实验类型：Time Series，设置Interval:0.01ms；Duration:5s；Expore Time:15ms；两个荧光通道参数一致并分别延时成像；最终实际图像时间间隔为60ms。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，

使用ImageJ对Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS)胚胎的心脏处Ca²⁺浓度进行定量分析。

9.权利要求1-3任一项所述构建方法或权利要求5-8任一项所述斑马鱼心肌组织钙成像分析及钙离子浓度监测的方法在如下任意一种或多种中的应用：

(a)生物体相关基础研究；

(b)心血管系统药物筛选。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述(a)中，生物体相关基础研究包括生物体心肌细胞钙信号的变化、生物体心血管系统的生理功能和生物体发育机制研究；进一步的，所述生物体为斑马鱼。