[发明专利]一种斑马鱼心肌特异表达钙离子信号指示探针品系的构建方法及其应用

说明书

本发明属于动物模型构建和钙离子检测分析技术领域，具体涉及一种斑马鱼心肌特异表达钙离子信号指示探针品系的构建方法及其应用。具体的，本发明利用tol2转基因系统，在GCaMP6s报告基因的前面加一段心肌组织中特异性表达的启动子序列(myl7)，构建了心肌特异表达钙离子浓度的指示探针品系鱼，可以在心肌组织中表达荧光探针，结合斑马鱼活体成像技术，实时监测心肌组织中钙离子的浓度情况，因此可用于研究生物体心肌细胞钙信号的变化、系统的生理功能和发育机制以及相关药物筛选，因此具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于动物模型构建和钙离子检测分析技术领域，具体涉及一种斑马鱼心肌特异表达钙离子信号指示探针品系的构建方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

GCaMP6s是单个绿色荧光蛋白(GFP)、钙调蛋白(CaM)和平滑肌细胞肌球蛋白轻链激酶片段M13融合的产物。其中GFP是环状序列改变的增强型绿色荧光蛋白(EGPF)，用六肽GGTGGS将EGFP的N末端与C末端连接起来，同时将EGFP氨基酸序列上特定位置的肽键断开，产生新的N末端与C末端。C末端结合CaM，N末端结合M13片段，作为CaM结合的靶序列。

CaM结合钙离子后发生变构，环绕在M13肽周围，以其铰链区和M13结合，Ca²⁺-CaM-M13相互作用，引起EGFP生色基团环境改变，从而使GCaMP6s的荧光强度明显增加，发出绿色荧光。CaM和M13的结合与钙离子结合相偶联。与基因编码的其他钙离子指示剂(如GCaMPs、GCaMP3、GCaMP5s等)相比，GCaMP6s的动力学更快、灵敏度更高，适合低频信号的指示。GCaMP6s蛋白的这种物理性质使其可以报告钙离子的浓度。但是发明人发现，鲜有基于上述荧光蛋白特性在斑马鱼中对心肌细胞钙信号等进行研究的相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种斑马鱼心肌特异表达钙离子信号指示探针品系的构建方法及其应用。本发明成功构建了一种心肌特异表达钙离子浓度的指示探针品系斑马鱼，其可以在心肌组织中表达荧光探针，同时结合斑马鱼活体成像技术，能够实时监测心肌组织中钙离子的浓度情况。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为了实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种斑马鱼心肌特异表达钙离子信号指示探针品系的构建方法，所述方法包括：

S1、构建重组质粒myl7:GCaMP6s-CAAX，具体的，以转座载体pTol2为骨架，将myl7-GCamp6s片段插入其中获得；

S2、将上述重组质粒myl7:GCaMP6s-CAAX与Tol2转座酶mRNA转入斑马鱼胚胎，筛选并鉴定得稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为斑马鱼心肌特异表达钙离子指示探针品系(Tg(myl7:GCaMP6s))。

本发明的第二个方面，提供上述构建方法在斑马鱼钙成像分析及钙离子浓度监测中的应用。

本发明的第三个方面，提供一种斑马鱼心肌组织钙成像分析及钙离子浓度监测的方法，所述方法包括：

S1、将携带有GCaMP6s和DsRed表达的斑马鱼(Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS))胚胎首先置于2,3-丁烷二酮一肟溶液中，然后再摆放入甲基纤维素中；

S2、选择特定激发光波长并设定延时成像条件参数，对步骤S1处理后的斑马鱼胚胎的心脏区域进行延时成像；

S3、对上述携带有GCaMP6s和DsRed表达的斑马鱼胚胎心脏处Ca²⁺浓度进行定量分析。