[发明专利]细胞获得性转移诱导结肠炎的方法

权利要求书

1.一种细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；包括如下步骤：

S1、结肠炎模型复制：BALB/c小鼠依次自由饮用2.5％的DSS溶液、自由饮水以及自由饮用2.5％的DSS溶液；

S2、流式分选富集mTh17细胞：处理BALB/c小鼠得到单细胞悬液；染色缓冲液重悬细胞，400g/min离心4min弃上清，重复2次；染色缓冲液重悬细胞，受体阻断剂封闭；分别加入流式抗体，室温避光孵30min；染色缓冲液重悬细胞，400g/min离心4min弃上清2次；染色缓冲液定容，经流式分选仪检测后，收集管富集结肠炎小鼠mTh17细胞；

S3、mTh17细胞获得性转移诱导结肠炎：SCID小鼠适应性饲养后，随机均分成PBS和mTh17组，mTh17组腹腔注射细胞混合液，PBS组注射等体积的PBS溶液；

S4、结肠炎样品采集：收集小鼠结肠并预处理；将结肠组织滤纸吸干后称重；取近端结肠置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，余下组织液氮速冻后转移至-80℃冰箱备用；

S5、疾病活动指数评定：实验过程中，小鼠称重及观察粪便粘稠度、便血情况，根据体重损失、粪便粘稠度和便血情况的评定疾病活动指数；

S6、病理组织的处理：一、石蜡切片：a1、固定结肠组织：将近端结肠置于4％多聚甲醛溶液中固定24h；a2、修块：修剪结肠组织至0.5-1.0cm厚，肠腔与水平面平行；a3、脱水；a4、透明；a5、浸蜡：a6、包埋结肠组织；a7、结肠石蜡切片制备；二、苏木素-伊红染色：b1、脱蜡：采用二甲苯脱蜡8min；b2、梯度酒精复水；b3、苏木素染色；b4.伊红染色；将结肠组织置于伊红染液2min；自来水洗2min；b5、脱水：依次采用95％乙醇浸泡3min；100％乙醇浸泡3min；100％乙醇浸泡3min；b6、透明：采用二甲苯浸泡5min；b7、封片：中性树胶封片，盖上盖玻片；b9、光学显微镜下采集各组结肠病理图片。

2.根据权利要求1所述的细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；所述S2中处理BALB/c小鼠得到单细胞悬液的具体步骤为：分离新鲜的BALB/c小鼠脾脏组织，置于RMPI1640培养基中，充分碾碎组织，滤膜过滤，红细胞裂解液裂解红细胞，PBS溶液洗涤两次，制备单细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；所述S2中流式抗体为CD4、CD73。

4.根据权利要求1所述的细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；所述S3中mTh17组腹腔注射的细胞混合液为：5.0×10⁵个CD4⁺CD73⁺mTh17细胞混合液。

5.根据权利要求1所述的细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；所述S4中小鼠结肠预处理的步骤为：将小鼠结肠于1×PBS溶液4℃过夜预冷，剪去盲肠端组织，用5.0mL注射器抽取PBS溶液，通过灌胃针注入结肠组织，清洗肠腔内容物，反复数次至结肠内容物清洗干净。

6.根据权利要求1所述的细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；所述S6中a3脱水采用60％、70％、80％、90％、95％乙醇于室温下依次各浸泡结肠组织1.0h；采用无水乙醇室温下浸泡0.5h。

7.根据权利要求1所述的细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；所述S6中a4透明采用无水乙醇与二甲苯的体积比为2：1，室温下浸泡15min，无水乙醇与二甲苯的体积比为1：2，室温下浸泡7.5min，二甲苯室温下浸泡1.5min。

8.根据权利要求1所述的细胞获得性转移诱导结肠炎的方法，其特征在于；所述S6中a7结肠石蜡切片制备的具体步骤为：通过石蜡切片机，制成4μm厚的切片；置于摊片机中摊平，预先加入超纯水，水温设置在45℃；载玻片捞出切片，置于预先设置温度为50℃的烤片机烘烤至水分蒸干。