[发明专利]藜麦原生质体、制备方法以及梭梭耐逆基因瞬时表达体系

说明书

本发明公开了一种藜麦原生质体、制备方法以及梭梭耐逆基因瞬时表达体系。本发明通过将预处理的藜麦幼嫩子叶切取成0.5～1mm宽的细长条后置于酶解液中，25℃恒温条件下避光酶解10.5h，50rpm·minsupgt;‑1/supgt;震荡1.5h，得到酶解液；其中，所述酶解液pH为5.7、酶解液组成为0.3％MacerozymeR‑10+1.2％Cellulase‑R10+0.6mol·Lsupgt;‑1/supgt;甘露醇+20mmol·Lsupgt;‑1/supgt;MES+20mmol·Lsupgt;‑1/supgt;KCl+10mmol·Lsupgt;‑1/supgt;CaClsubgt;2/subgt;+0.5％PVP+1g·Lsupgt;‑/supgt;supgt;1/supgt;BSA；往所述酶解液中添加等体积的W5水溶液，经100目筛网过滤，在室温、100×g速率下离心4min，弃上清液体，得到藜麦原生质体，该藜麦原生质体产量高、活力高、制备周期短、操作难度小，能用于建立基于藜麦原生质体的梭梭耐逆基因瞬时表达体系。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种藜麦原生质体及其制备方法，以及基于该藜麦原生质体的梭梭耐逆基因瞬时表达体系。

背景技术

植物原生质体是指完全消除细胞壁的植株活细胞，其继续保持活体细胞一般的生长、分裂等生物活力，在特定的生长环境下，依然能够具有继续形成出新的植物能力的细胞。植物原生质体技术目前已被广泛应用于植物基因组定位、启动子活性、蛋白相互作用和植物育种技术等方面的研究，而基于植物原生质体的相关技术开发也已经成为了植物分子生物学科研的主要技术手段，原生质体瞬时分析系统已被广泛用于利用细胞和生化方法对基因进行快速功能分析。尽管对某些模式的植物原生质体的酶解分离技术已相当完善，但是几乎全部的研究资料都已经指出，对于不同的植物类型，或者同种植物不同的被试细胞材料，其对原生质体的分离能力也有着巨大差别。酶解液配合浓度、渗透剂浓度和酶解时间对酶解法制备原生质体有着及其重要的影响。

制备成熟的原生质体体系已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中取得成功。目前，在制备原生质体的方面前人研究已对玉米(Zea mays)根尖组织、橡胶树(Heveabrasiliensis)、矮牵牛(Petunia hybrida)、水稻(Oryza sativa)、杉木(Cunninghamialanceolata)、苹果(Malus pumila)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、苦荞(Fagopyrumtataricum)、油菜(Brassica campestris)等叶片，荔枝(Litchi chinensis)、大豆(Glycine max)等愈伤组织，红豆草(Onobrychis viciifolia)下胚轴，以及梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝的原生质体分离条件进行了优化，获得较为成熟的原生质体瞬时表达体系。在制备原生质体时，不同部位对分离时的条件不同，分离成活效果也大相径庭，叶片往往能更容易分离出大量的原生质体。研究发现加入合适浓度的PVP能够防止原生质体褐化，提高原生质体的成活率。但是，通过愈伤组织获得原生质体相对直接采用现成的植物材料，操作难度较大，所需时间较长，不利于研究与叶片叶绿体相关的目标基因的表达定位分析。1992年有报道制备了藜麦(Chenopodium quinoa)原生质体，但其制备藜麦原生质体方法时间较长，且需要辅助病毒参与才能进行原生质体转化。因而优化其制备方法有助于对后续藜麦的研究。

藜麦是世界范围内广泛种植的一种异源四倍体盐生假谷物作物，源于南美洲安第斯高原提提喀喀湖地区，为一年生苋科(Amaranthaceae)藜属(Chenopodium)植物，也被称作印第安麦、南美藜、奎藜等。是唯一经过认定的能够提供人体基本营养且具有一定药用价值的单体食物。藜麦具有一定的抗寒性，能够在我国的高寒，高海拔地区种植，不仅可以丰富高海拔地区的特色农作物种类，还有助于缓解我国的粮食紧张问题。近年来，随着人们对健康的关注和高品质生活的追求，对藜麦的需要量正迅速上升，加之藜麦可有效减少全国粮食安全，目前对其的种植和养殖技术等基础研究都已形成体系热点。