[发明专利]利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法

说明书

本发明提供利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，属于遗传工程技术领域，所述方法包括诱导培养和维持培养；所述诱导培养的方法为将人脐带间充质干细胞在诱导培养基中进行培养，得到pre‑iPSCs细胞；所述诱导培养基以高糖DMEM为基础培养基，添加维生素C、氯化锂、烟酰胺、Forskolin、bFGF、15d‑PGJ2、原钒酸钠、丙戊酸、5‑氮杂胞苷、EPZ004777、DNZep、Y‑27632、CHIR99021、SB431542、JNK‑IN‑8、PD98059、TTNPB、PD173074、ABT‑869；本发明重编程诱导多能干细胞的方法，诱导时间短且诱导效率高。

技术领域

本发明涉及利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力和分化为特定细胞的多潜能细胞。干细胞来源包括胚胎干细胞(ESCs)、成体干细胞(ASCs)或脐带血干细胞等。由于从人类胚胎中提取ESCs具有争议性，以及研究资金的限制和潜在的致瘤性。而使用成体干细胞的优势在于，它们来源于同一个患者，并返回给同一个患者，因此不存在免疫介导的排斥反应；但它主要的缺点是这些细胞通常缺乏胚胎干细胞的可塑性和多能性，因此它们的潜能是不确定的。

在成人组织中重新编程体细胞，以创造多能ES样细胞是解决干细胞来源问题的一种方法。2006年，山中伸弥的团队发明了一种由OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells,简称“iPSCs”)。iPSCs细胞既避免了胚胎干细胞的伦理限制，又解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。

目前，重编程方法有多种，主要为病毒载体（逆转录病毒或慢病毒，CN109913494A）、DNA法（CN112266935A、CN109628383A）、RNA和蛋白质法、化学小分子药物法。前3种方法均涉及到核酸，在重编程过程中可能整合到活跃的内源性基因附近，甚至可能导致癌症或肿瘤抑制基因突变的激活或失活。而化学小分子药物法解决了目前许多研究者面临的问题，但存在重编程诱导时间长、诱导效率低下的问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种利用化学小分子药物诱导人脐带间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的方法，实现以下发明目的：缩短诱导时间，提高诱导效率。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，所述方法包括诱导培养和维持培养；所述诱导培养的方法为将人脐带间充质干细胞在诱导培养基中进行培养，得到pre-iPSCs细胞；所述诱导培养基以高糖DMEM为基础培养基，添加50μg/mL的维生素C、5mM的氯化锂、1mM的烟酰胺、10μM的Forskolin、100ng/mL的bFGF、1μM的15d-PGJ2、100μM的原钒酸钠、200μM的丙戊酸、10μM的5-氮杂胞苷、5μM的EPZ004777、0.2μM的DNZep、10μM的Y-27632、10μM的CHIR99021、5μM的SB431542、1μM的JNK-IN-8、1μM的PD98059、2μM的TTNPB、1μM的PD173074、1μM的ABT-869。

所述维持培养，将诱导培养得到的pre-iPSCs细胞采用维持培养基进行培养，得到iPSCs细胞；所述维持培养基以含有1%Vol的N2、2%Vol的B27、1%Vol的谷氨酰胺、1%Vol的MEM非必需氨基酸溶液、50μg/mL的维生素C的高糖DMEM为基础培养基，加入1μM的CHIR99021、10μM的Y-27632、1μM的PD0325901、2μM的IWP-2、0.5μM的SB590885、500μM的丙戊酸、10μM的Tranylcypromine、0.05μM的DZNep、5μM的EPZ004777。