[发明专利]一种产泰乐菌素A的重组菌株及其生产泰乐菌素的方法

说明书

本公开属于微生物和生物技术领域，具体涉及一种产泰乐菌素A的重组菌株及其生产泰乐菌素的方法。更具体来说，本公开涉及一种重组链霉菌、包含链霉菌的细胞培养物及用途，和生产泰乐菌素的方法。本公开以星海湾链霉菌为出发菌株，增强了星海湾链霉菌中泰乐菌素合成通路关键酶的表达，构建得到了生产泰乐菌素的重组微生物菌株T0771。利用所述重组菌株发酵生产泰乐菌素，可降低副产物泰乐菌素D的产生、使其含量降低至3％以下，并将泰乐菌素C全部转化为泰乐菌素A，因此显著了提升泰乐菌素A的产量及纯度(≥97％)。

技术领域

本公开属于微生物和生物技术领域，具体涉及一种产泰乐菌素A的重组菌株及其生产泰乐菌素的方法。更具体来说，本公开涉及一种重组链霉菌、包含链霉菌的细胞培养物及用途，和生产泰乐菌素的方法。

背景技术

泰乐菌素是由弗氏链霉菌等放线菌产生的一类大环内酯类抗生素，其结构是由一个十六元内酯环和碳霉氨基糖(mycaminose)，红霉糖(mycarose)和6’-脱氧-D-阿洛糖(mycinose)三个糖苷配基组成。市售泰乐菌素是多组分的混合物，其中泰乐菌素A占90％，其生物活性最优。鉴于对革兰氏阳性菌、螺旋体、支原体等都有优良的生物活性，泰乐菌素不仅被作为动物饲料药物添加剂，也可作为半合成原料，用于生产活性更好、附加值更高的替米考星和泰万菌素等衍生物，具有良好的国内和国际市场前景。

泰乐菌素主要是通过微生物发酵合成。在发酵过程中，存在四种主要成分：泰乐菌素A，去碳霉糖的泰乐菌素B，泰乐菌素C(大菌素)和泰乐菌素D(雷洛菌素)，其中泰乐菌素A为药效组分。在发酵初期，以泰乐菌素A为主。随着发酵时间的延长，A和C的组分比例发生变化，即C组分不断增加，由此推测C组分转化为A组分的酶活力不强，造成了C组分的积累。故在发酵后期需要将C定向转化为A。此外，泰乐菌素发酵液中的杂质组分泰乐菌素D一直是困扰泰乐菌素产品纯度的难点。泰乐菌素D与泰乐菌素A性质相近、难以消除，也为后续半合成泰乐菌素衍生物引入了杂质，而额外增加纯化分离步骤将提高成本。

常规的菌株选育和复壮是维持和提升菌株效价的通用策略。例如，引用文献1中公开了一株通过诱变即定向筛选到的弗氏链霉菌SF-4，通过在该菌株的发酵过程中添加铵盐的方法，从而促进了泰乐菌素C组分转化为A组分。此外，在深入研究泰乐菌素生物合成机制的基础上，利用生物技术体系，从基因水平对生产菌株进行遗传改造，提升限速步骤的基因表达水平。引用文献2以泰乐菌素生产菌株弗氏链霉菌SWL00020为出发菌株，通过敲除其基因组中的基因tylCVII、tylCV、tylCVIII、tylCIV和tylCII，实现了只产泰乐菌素B而不产泰乐菌素A。引用文献3中公开了在弗氏链霉菌TL-209中转入过表达泰乐菌素合成关键限速酶基因tylF以及透明颤菌血红蛋白基因vhb的重组质粒，并将重组菌株于30L发酵条件下发酵，泰乐菌素产量可达到17000～18000u/mL，泰乐菌素A组分的含量可达到94％～95％。

目前泰乐菌素通常是通过微生物发酵获得，杂质组分泰乐菌素C和D在发酵过程中产生并积累，需要通过提高温度，将泰乐菌素C完全转化为泰乐菌素A，且在此过程中泰乐菌素D进一步增加，通常在5％以上，影响了产品纯度，不符合泰乐菌素市场要求(≤3.5％)。鉴于泰乐菌素多组分的产生通常源于生物合成途径中的后修饰基因(图1)，后修饰基因的表达水平低会导致中间产物的积累，而影响最终产物的产量。因此针对限速的后修饰基因进行合理改造优化，将有望实现有效组分泰乐菌素A的产量提升，同时降低其他杂质组分。

引用文献：

引用文献1：CN111139197A；

引用文献2：CN103849591A；

引用文献3：CN102690775A。

发明内容

发明要解决的问题