[发明专利]检测谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记的方法

说明书

本发明提供了一种检测谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明通过对分子标记的筛选以及gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及检测谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记的方法，尤其涉及检测谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记的方法，尤其涉及基于CRISPR技术检测与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9的方法、系统和试剂盒。

背景技术

谷子(拉丁名：Setaria italica)属禾本科的一种植物，古称稷、粟，亦称粱。在我国谷子是特色抗旱作物，种子萌发只需要占其重量26％的水分，而高粱、小麦和玉米的种子萌发分别需要其重量的40％、45％和48％的水分，同时谷子对低土壤肥力的耐力较高，但目前谷子种植面积不断缩减。谷子抗除草剂品种在生产上应用较少，谷子种植需要人工除草，这一直是阻碍谷子产业化发展的主要因素之一。

咪唑乙烟酸是一种重要的单子叶植物除草剂。咪唑乙烟酸是咪唑啉酮类除草剂的典型代表，是目前世界上最重要的除草剂品种之一，也是目前使用量最大的除草剂之一，广泛用于大豆和小麦等农作物的杂草控制。咪唑乙烟酸可以抑制乙酸乳酸合成酶(ALS)活性，以阻止支链氨基酸的生物合成，导致蛋白质的合成受到阻碍，从而使植物体生长停止，最终杀死生物个体。咪唑乙烟酸是广谱除草剂，能有效防除双色高粱、西风古、小觅、曼陀罗、稗草、黍、金狗尾、绿狗尾、筒麻、反枝苋和藜等杂草。

培育抗除草剂的谷子新品种是实现谷子规模化和机械化种植的重要基础。用分子标记进行基因定位和基因定向导入，是非常重要的育种手段。但分子标记的准确性、易用性对育种的成败至关重要。

本发明提供了一种新型的检测与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于Cas12i蛋白的trans活性，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的快速检测方法。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因连锁分子标记检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种用于检测谷子抗咪唑乙烟酸除草剂的gRNA，所述gRNA包括与Cas12i蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3-4任一所示，所述靶核酸为来源于谷子基因组。

本发明中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。

在一个实施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，并且与SEQID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3-4任一所示的序列。

在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。

所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或SEQID No.1的互补序列的连续30个碱基互补配对。

优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.7所示。