[发明专利]一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系及其方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系，其特征在于，所述检测体系包括适用于新型冠状病毒即时检测的恒温扩增引物和

CRISPR/Cas12a反应体系；

所述恒温扩增引物为针对新型冠状病毒N基因的特异性恒温扩增引物；

所述恒温扩增引物为N-F/R，核酸序列如下：

编号      引物      序列(5’-3’)

No1       N-F       AGGCA GCAGT AGGGG AACTT CTCCT GCTAG AAT

No2       N-R       TTGGC CTTTA CCAGA CATTT TGCTC TCAAG CTG；

所述CRISPR/Cas12a反应体系包括：针对新型冠状病毒N基因的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和单链DNA报告系统；

所述特异性crRNA为N-crRNA1，N-crRNA1的核苷酸序列如下：

编号      引物      序列(5’-3’)

                    UAAUU UCUAC UAAGU GUAGA UCUGC UGCUU

No3       N-crRNA1

                    GACAG AUUGA A；

所述单链DNA报告系统包括用于侧流层析试纸条检测的荧光探针F-B，荧光探针F-B为5’-FAM-TTATTATT-Biotin-3’，或用于荧光检测的荧光探针F-Q，荧光探针F-Q为5’-FAM-CCCCCC-BHQ1-3’。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系，其特征在于，所述侧流层析试纸条包括底板，所述底板上依次粘附有硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫和吸收垫；所述金标垫上包被有被胶体金标记的抗荧光素抗体；所述硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由山羊抗小鼠IgG抗体构成的检测线。

3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系，其特征在于，所述侧流层析试纸条的制备方法包括以下步骤：

(1)柠檬酸钠还原四氯金酸的方法制备胶体金纳米粒子；

(2)用步骤(1)所制备的胶体金混合抗荧光素抗体制备金标抗体；

(3)用步骤(2)所制备的金标抗体均匀涂抹至玻璃纤维材质，制备金标垫；

(4)用笔分别蘸取链霉亲和素和山羊抗小鼠IgG抗体，在硝酸纤维素膜上画C线和T线；

(5)组装试纸条：将PVC基板、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、吸收垫层层组装，裁剪成合适大小可直接用于检测。

4.一种基于权利要求1-3任一项所述的一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品核酸；

(2)采用所述恒温扩增引物扩增待测样品中的目标片段：以步骤(1)提取的核酸为模板，将恒温扩增引物加入恒温扩增体系中，进行恒温扩增，得到特异性扩增产物；

(3)利用所述CRISPR/Cas12a反应体系检测样品中的新型冠状病毒核酸：将步骤(2)制备的特异性扩增产物加入到CRISPR/Cas12a反应体系中，进行恒温扩增，反应产物通过侧流层析试纸条或荧光检测方法进行检测。

5.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测方法，其特征在于，所述恒温扩增体系和CRISPR/Cas12a反应体系均为冻干试剂。

6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测方法，其特征在于，所述冻干试剂的制备方法包括以下步骤：

(1)配置恒温扩增冻干体系，将恒温扩增引物、酶、醋酸镁以及缓冲液在冻干条件下混合冻干；

(2)配置CRISPR/Cas12a冻干体系，将特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和单链DNA报告系统、缓冲液及冻干保护剂在冻干条件下混合冻干。