[发明专利]一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系及其方法

说明书

本发明涉及生物化学中核酸检测技术领域，提供了一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系及其方法，包括适用于新型冠状病毒即时检测的恒温扩增引物和CRISPR/Cas12a反应体系，所述恒温扩增引物为针对新型冠状病毒N基因的特异性恒温扩增引物；所述恒温扩增引物为N‑F/R；所述CRISPR/Cas12a反应体系包括：针对新型冠状病毒N基因的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和单链DNA报告系统，通过恒温扩增‑CRISPR/Cas12a的侧流层析试纸条检测方法有较高的特异性和灵敏度，在35min分钟左右实现可视化检测，结果准确可靠；冻干试剂简化了操作流程，加快实验进程，摆脱冷链运输，节省运输成本，在37℃恒温条件下即可进行反应，结果判读简单，肉眼可见，适合家庭化核酸自测。

技术领域

本发明涉及生物化学中核酸检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系及其方法。

背景技术

新冠病毒检测方法主要包括核酸检测和抗原抗体检测。抗原抗体检测高效便利，但由于抗体检测存在窗口期的滞后性，抗原检测灵敏度差、准确率低，因此，不能作为早期诊断的方式。核酸检测作为新型冠状病毒感染筛查诊断和病情监测的主要手段，能够检测到处于窗口期的感染者，及早发现感染者。但目前最主要的核酸检测方法是反转录实时荧光定量PCR，该方法由于需要依赖温控精度较高的热循环仪，并且反应必须的变性、退火和延伸步骤使整个扩增检测时间较长(～2h)，难以实现核酸分子的现场快速检测。目前急需一种无需设备、快速且能直接判读的检测方法，可以满足基层医疗、传染病防控、偏远地区医学检验和家庭个性化诊断的需求。

恒温扩增是在重组酶及其他酶的共同作用下对目标模板进行指数扩增，不需要温度循环，简化了对专业仪器的要求，同时也能够弥补传统PCR检测技术设备依赖和检测周期长的不足，因此在核酸即时检测方面具有较大的实际应用价值。但是该扩增技术直接用于核酸即时检测时仍然存在扩增效率较低、检测灵敏度不足、反应时间较长、存在非特异性扩增等问题。CRISPR/Cas系统具有基因编辑功能，同时在分子诊断领域也得到广泛应用。crRNA引导Cas12a特异性识别目标核酸序列并进行切割，同时激活Cas12a的反式切割活性，即Cas12a非特异性切割体系中的单链DNA探针，通过捕获探针信号，可以判定样本中是否含有待测病毒。将恒温扩增技术与Cas12a酶切信号放大系统相结合，可以提高核酸检测的灵敏度和特异性，弥补单一扩增方法效率低的不足之处。但该方法检测流程需要多步移液和加样步骤，操作复杂，不仅摆脱不了移液器和离心机等实验室设备，而且需要受过训练的实验人员进行操作。另外，反应所需的大多数试剂需存放在-20℃，这也限制了该检测方法的推广和应用。

在实验中，各类核酸检测试剂分别独立保存在低温环境中，使用时需要现场配置，操作复杂且容易造成交叉污染；同时核酸检测试剂运输也需要低温环境，这使得核酸即时检测受到限制。为解决核酸检测试剂低温储存和运输的限制，需要对其保存方法不断的探索，从而实现常温保存和运输。

发明内容

为了解决现有技术中的核酸检测试剂存在低温储存和运输的限制的问题，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系及其方法。

第一方面提供了一种基于CRISPR/Cas12a的新型冠状病毒核酸即时检测体系，所述检测体系包括适用于新型冠状病毒即时检测的恒温扩增引物和CRISPR/Cas12a反应体系；

所述恒温扩增引物为针对新型冠状病毒N基因的特异性恒温扩增引物；所述恒温扩增引物为N-F/R，核酸序列为：