[发明专利]重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1毒株及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一株重组人腺病毒5型‑诺如病毒GII.4‑VP1毒株及其制备方法和应用，属于病毒学技术领域。本发明通过基因重组技术将诺如病毒的目的蛋白的基因插入包含腺病毒5型的基因组的单拷贝质粒中构建出重组质粒，然后经酶切线性化、转染、病毒拯救、纯化等步骤获得重组腺病毒颗粒。其表达的病毒样颗粒的构象与天然诺如病毒类似，且颗粒形态完整。该重组腺病毒颗粒经灌胃给药小鼠后，可诱导诺如病毒中和抗体及肠道黏膜IgA的产生。本发明证实了以重组人腺病毒5型为载体，表达的诺如病毒的目的蛋白可在哺乳动物细胞中自组装形成诺如病毒VLP，为以人腺病毒为载体的诺如病毒口服疫苗的研发提供了技术支持。

技术领域

本发明属于病毒学技术领域，具体涉及一株重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1毒株及其制备方法和应用。

背景技术

诺如病毒(Noroviruses，NoVs)为杯状病毒科(Caliciviridae family)诺如病毒属(Norovirus genus)的单股正链RNA病毒，是引起急性肠胃炎的主要病原体之一。根据其病毒衣壳蛋白基因(VP1)编码的氨基酸序列差异，可将诺如病毒分为7个不同的基因组：GⅠ～GⅦ。GⅠ、GⅡ、GⅣ有在人际中传播的能力。其中，GⅡ组4型(GII.4)是目前世界范围内引发急性肠胃炎病例最多的诺如病毒优势流行株。

诺如病毒没有合适的体外细胞培养体系，使得诺如病毒疫苗的研发进程受到了严重的限制。诺如病毒衣壳由主要结构蛋白VP1和次要结构蛋白VP2组成。研究表明，仅由90个二聚体形式的VP1，共180个亚基即可以自组装形成一个直径约40nm的二十面体病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)。由VP1蛋白包装形成的VLPs在形态和抗原性上与具有传染性的诺如病毒颗粒类似。

口服给药对诺如病毒疫苗而言，是一种极具吸引力的给药方式。与传统的肌肉注射相比，口服免疫途径能够将疫苗直接递送到诺如病毒的侵染部位。而因为人腺病毒5型(hAd5)能够感染人的肠道组织，当将重组腺病毒递送到肠道部位后，重组腺病毒能够进入到黏膜细胞，在细胞内部表达其所携带的抗原基因。产生的抗原蛋白能有效刺激机体黏膜免疫反应，产生特异性IgA，从而使机体能够抵抗病毒的感染。因此，研究以腺病毒5型作为载体的诺如病毒疫苗对诺如病毒的防治具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1毒株(Recombinant human adenovirus)。所述毒株命名为rAd5/NoV-GⅡ.4-VP1，已于2023年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，湖北武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：V202308。

该毒株能够在哺乳动物细胞中高效表达诺如病毒的目的蛋白，并自组装为诺如病毒的病毒样颗粒。

本发明的第二个目的是提供所述重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1毒株(Recombinant human adenovirus)的制备方法，该方法通过基因重组技术将诺如病毒的目的蛋白的基因插入腺病毒5型的基因组中构建出重组质粒，该重组质粒经酶切线性化、转染、病毒拯救、纯化等步骤获得重组腺病毒颗粒。

具体的，该方法包括以下步骤：

重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1毒株(Recombinant human adenovirus)的制备方法，包括以下步骤：

(1)将诺如病毒的目的蛋白的基因序列插入到包含腺病毒5型的基因组的单拷贝质粒中构建重组质粒；

(2)将所述重组质粒经酶切线性化后，转染至哺乳动物细胞中进行传代培养，拯救出重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1，收集含病毒样颗粒的病毒收获液；

(3)对所述病毒收获液进行扩大培养、纯化，得到重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1毒株。