[发明专利]一种增强型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在于，所述的增强型Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子含有编码上述的增强型Pfu DNA聚合酶的核苷酸序列，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括权利要求3所述的表达载体。

5.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括增强型Pfu DNA聚合酶和DNA结合蛋白Sso7d；所述的融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.一种突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为在Pfu-Sso7d的基础上进行的V93K突变蛋白；所述的突变蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.根据权利要求1所述的增强型Pfu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以Pfu-Sso7d的DNA序列为模板，P1和P2作为引物，获得的PCR进行酶切，链接到表达载体上转化感受态细胞，测序获得正确的阳性表达质粒，将质粒转化表达工程菌，获表达菌株；

(2)将步骤(1)中获得表达菌株接种到培养基中培养，得过夜培养物；

(3)将步骤(2)获得的过夜培养物接种到培养基中，加入诱导剂，离心，收集菌体；

(4)将步骤(3)中菌体进行破菌，粗酶处理后获得所述的增强型Pfu DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的Pfu-Sso7d的DNA序列如SEQ IDNO:3所示；所述的引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述的P2的核苷酸序列如SEQID NO:8所示。

9.权利要求1所述的增强型Pfu DNA聚合酶或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的宿主细胞或权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所述的突变蛋白或权利要求7-8任一项所述的制备方法制备得到的增强型Pfu DNA聚合酶在核酸扩增体系中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的增强型Pfu DNA聚合酶的核酸扩增反应体系包括Tris-H₂SO₄、K₂SO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、甜菜碱和Triton X-100。