[发明专利]一种增强型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种增强型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用，涉及分子生物学技术领域。所述的增强型Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明制备的增强型Pfu DNA聚合酶具有高保真性、高灵敏度、快速、抗干扰能力强等特点，使用本发明制备的增强型Pfu DNA聚合酶能获得更理想的扩增结果，并大幅度缩短扩增时间，其保真性是普通Taq DNA酶的50倍，扩增速度是普通Pfu酶的数倍，延伸速度15‑30s/kb，扩增长度可达基因组DNA≤19kb，λDNA≤30kb。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种增强型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种DNA体外扩增技术，PCR技术在分子生物学领域最基本也是最重要的一项体外技术，这一重要过程是由DNA聚合酶催化而成。常见的DNA聚合酶按其忠实性可分为一般DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，和高保真DNA聚合酶，如Pfu DNA聚合酶。

一般DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，主要用于分子克隆、实时荧光定量PCR以及基因测序等。Taq DNA聚合酶的催化速度大于常规Pfu DNA聚合酶，但其在功能上没有像PfuDNA聚合酶的3'至5'核酸外切酶活力(校正活力)，使其没有校正功能，保真性大大降低。

Pfu DNA聚合酶是一种高度热稳定的DNA聚合酶，该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50),Pfu DNA聚合酶的分子量为90kD，可以催化5'至3'方向依赖于DNA模板的脱氧核苷酸聚合，并且Pfu DNA聚合酶同时具有5'至3'聚合酶活性和3'至5'核酸外切酶活力(校正活力)，在催化核酸聚合的同时可纠正聚合反应过程中错误掺入的碱基，这种校正功能使得PCR能获得很好的保真性，但同时也是其延申速度受到限制。

中国专利CN202111511759.2中公开了一种Pfu DNA聚合酶，所述的Pfu DNA聚合酶经透析过的蛋白浓度为1.2mg/mL。该发明中提供了Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列和编码PfuDNA聚合酶的基因及携带上述基因的表达载体和携带表达载体的宿主细胞。该发明的PfuDNA聚合酶C端带有8个His标签，增加了纯化后的回收率。该发明的Pfu DNA聚合酶的延伸速度达到了野生型的6-8倍，同时提高了保真性。

中国专利CN201610839500.3中公开了一种增强型Pfu DNA聚合酶，所述的增强型Pfu DNA聚合酶中引入了一种非特异性双链DNA结合结构域，所述的非特异性双链DNA结合结构域为Sso7d。该发明公开了表达纯化增强型Pfu DNA聚合酶的方法，以及相应的缓冲液，该发明提供的增强型Pfu DNA聚合酶能解决Pfu DNA聚合酶本身扩增速度慢的缺点，使其延伸速度达到了野生型的10倍。具有较快的延伸速度。

本发明提供了一种在保证其保真性的基础上进一步提高其延伸速度的增强型PfuDNA聚合酶。该发明的增强型Pfu DNA聚合酶使得PCR能获得很好的保真性，错配率约为TaqDNA聚合酶的1/50。最快延伸速率可达5-6kb/min，对于复杂模板也可达到2kb/min。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述的PfuDNA聚合酶的延伸速度快，具有高保真特性，解决了Pfu DNA聚合酶延伸速度慢的问题。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种增强型Pfu DNA聚合酶，所述的增强型Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

又一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述的核酸分子含有编码上述的增强型Pfu DNA聚合酶的核苷酸序列，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。