[发明专利]mRNA加帽酶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种制备可溶性mRNA加帽酶的方法，包括如下步骤：

(A1)将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；所述融合蛋白为将促溶标签MBP和来源于病毒的加帽酶通过连接肽融合而成；所述来源于病毒的加帽酶选自如下任一：来源于蓝舌病毒的加帽酶、来源于浮病病毒的加帽酶、来源于非洲猪瘟病毒的加帽酶、来源于小球藻病毒的加帽酶；

(A2)对所述重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体进行裂解，离心后从上清液中获得所述融合蛋白，即为可溶性mRNA加帽酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述融合蛋白自N端到C端由所述促溶标签MBP、所述连接肽和所述源于病毒的加帽酶顺次连接而成；和/或

所述来源于蓝舌病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-644位或SEQ IDNo.1所示；和/或

所述来源于浮病病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第1-879位或SEQ IDNo.2所示；和/或

所述来源于非洲猪瘟病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-868位或SEQIDNo.3所示；和/或

所述来源于小球藻病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1-330位或SEQIDNo.4所示；和/或

所述促溶标签MBP的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；和/或

所述连接肽为柔性连接肽；进一步地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因为如下任一：

(B1)核苷酸序列如SEQ ID No.7的第1-3063位或SEQ ID No.7所示；

(B2)核苷酸序列如SEQ ID No.8的第1-3768位或SEQ ID No.8所示；

(B3)核苷酸序列如SEQ ID No.9的第1-3735位或SEQ ID No.9所示；

(B4)核苷酸序列如SEQ ID No.10的第1-2121位或SEQ ID No.10所示。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，所述融合蛋白的编码基因是通过重组载体的形式导入所述大肠杆菌受体细胞中的；

进一步地，所述重组载体为将所述融合蛋白的编码基因插入到pET-21a(+)的多克隆位点处所得；

和/或

所述大肠杆菌受体细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A2)中，所述诱导表达的条件为：37℃条件下，1mM IPTG诱导表达2h。

6.利用权利要求1-5中任一所述方法制备得到的可溶性mRNA加帽酶。

7.用于制备权利要求6所述可溶性mRNA加帽酶的成套产品，包括：

(C1)权利要求4中所述的重组载体；

(C2)权利要求1-4任一中所述的大肠杆菌受体细胞。

8.权利要求6所述可溶性mRNA加帽酶在对mRNA进行5’端加帽修饰中的应用。

9.一种mRNA体外转录-加帽方法，包括如下步骤：

S1、制备T7 RNA聚合酶，按照包括如下步骤的方法进行：

(a1)将融合了纯化标签的T7 RNA聚合酶的编码基因导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；所述融合了纯化标签的T7 RNA聚合酶为在T7 RNA聚合酶的N端融合了6His标签或8His标签；

(a2)对所述重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体进行裂解，离心后从上清中分离纯化获得T7 RNA聚合酶；

S2、按照权利要求1-5中任一所述方法制备得到mRNA加帽酶；

S3、先采用S1制得的T7 RNA聚合酶进行mRNA体外转录，然后采用S2制得的mRNA加帽酶对体外转录所得mRNA进行5’端加帽修饰。

10.一种用于mRNA体外转录-加帽的成套产品，包括：

(D1)权利要求9中所述融合了纯化标签的T7 RNA聚合酶；

(D2)权利要求6所述可溶性mRNA加帽酶。