[发明专利]mRNA加帽酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了mRNA加帽酶及其制备方法与应用。本发明提供了一种制备可溶性mRNA加帽酶的方法，包括：将融合了MBP标签的蓝舌病毒、浮病病毒、非洲猪瘟病毒或小球藻病毒来源的加帽酶编码基因导入大肠杆菌受体细胞，对所得重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体裂解，离心后从上清液中获得所述融合蛋白，即为可溶性mRNA加帽酶。本发明进一步构建了T7体外转录体系，进行加帽效果验证，结果发现来源于蓝舌病毒和浮病病毒的mRNA加帽酶被证明拥有比牛痘病毒加帽酶VCE更高的加帽活性。其中，来源于蓝舌病毒的mRNA加帽酶的活性要比VCE高出38％。本发明对于增强线形mRNA的稳定性并提高其在体内的翻译效率具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及mRNA加帽酶及其制备方法与应用。

背景技术

mRNA最早由Sydney Brenner和Francis Crick在1960年发现。与DNA的双链双螺旋结构不同，mRNA通常为一条单链的线型多核苷酸链，约占细胞总RNA的3％。由于A-U、G-C配对现象的存在，大多数mRNA均具有复杂的二级结构(发卡、茎-环等)。mRNA在生物细胞内通常由脱氧核糖核酸(DNA)转录而来。对于不同的生物细胞种类，对mRNA的转录后修饰均不相同。这也导致了mRNA在这些生物细胞中结构上的差异。一般来说，在非真核生物细胞中，mRNA几乎不需要转录后修饰。而在真核细胞中，mRNA前体通常要经历5’端加帽反应、3’端加尾反应以及除去内含子的剪接反应形成成熟mRNA。因此，对于真核细胞来说，完整的mRNA结构包括5’端的帽结构，5’端非翻译区域(Untranslated region，UTR)，蛋白质编码区域(Coding sequence，CDS)或开放阅读框(Open reading frame，ORF)，3’端非翻译区域和3’端多聚腺嘌呤尾巴。根据分子生物学中心法则，遗传信息的传递方式为由DNA作为模板转录得到RNA，再由RNA作为模板翻译得到蛋白质。因此mRNA的主要功能便是作为遗传信息传递的中间载体。这也导致了mRNA是细胞内最不稳定的一类RNA。其易降解的特性使得细胞能够很好的调控细胞内的mRNA水平，从而调控不同蛋白质的水平，维持细胞内的稳态。目前，mRNA被认为在医疗领域具有巨大的应用潜力。人们已经将mRNA应用在蛋白替代，基因编辑，核酸疫苗等领域。

目前，有化学合成和体外转录两种方式可以在体外得到mRNA。由于化学合成产量低且只能生产长度为50-70个核苷酸的mRNA，因此体外转录是目前主要的mRNA合成方式。体外转录一般只需要以下几个组分：DNA模板、反应缓冲液和噬菌体RNA聚合酶。体外转录所需的DNA模板一般为线性DNA模板。线性DNA模板可以通过线性化pDNA或者聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)获得。线性DNA模板易于在体外转录反应结束后用DNase I(Deoxyribonuclease I)进行消化并且减少转录后mRNA二聚体的产生。而目前使用的噬菌体RNA聚合酶通常来源于T7、SP6或T3噬菌体。其中，T7RNA聚合酶是目前最常见、使用最多的噬菌体RNA聚合酶。体外转录可以以较低的成本合成较长的mRNA。