[发明专利]一种分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法

说明书

本发明提供一种分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法，包括：将氨基酸衍生物与3种相关杂质加入容量瓶，用乙腈定容，摇动溶解，得到澄清透明溶液；采用HPLC对澄清透明溶液进行检测，利用LUX‑2手性柱作为分离载体，将流动相A和流动相B在不同的时间按照不同的比例进行混合，对所述澄清透明溶液进行洗脱，并采用面积归一化法确定所述澄清透明溶液中每种物质的出峰位置以及每种物质对应的含量；该方法能够在短时间内一次性将主成分与3种相关杂质进行有效分离检测。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法。

背景技术

N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-苏氨醇作为氨基酸衍生物的其中一种，是制备多肽产品的起始物料，然而，在制备多肽产品的生产过程中，N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-苏氨醇的各种杂质氨基酸会影响最终产品的品质，若能够在短时间内检测出氨基酸衍生物中的杂质情况，对于控制终产品的质量至关重要。

N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-苏氨醇Fmoc-L-Thr(tBu)-OL的起始物料苏氨醇L-Thr-OL中常常含有D-苏氨醇D-Thr-OL、L-别苏氨醇L-Allo-Thr-OL、D-别苏氨醇D-Allo-Thr-OL，从而导致生产出来的氨基酸衍生物中含有Fmoc-D-Thr(tBu)-OL,Fmoc-L-Allo-Thr(tBu)-OL,Fmoc-D-Allo-Thr(tBu)-OL3种手性杂质。由于这些手性杂质的化学性质相似，物理性质也相近，常规方法难以拆分和定量分析。加之杂质含量相对较低，检出难度加大。目前常见的氨基酸衍生物检测方法有薄层层析TLC检测法、荧光FS检测法、紫外UV检测法等。但是，薄层检测主要是半定量分析，不能确认其准确含量；荧光检测主要采用诱导剂，操作繁琐，容易出错；紫外检测法主要采用高效液相HPLC检测，其操作方便，检测速度快，结果准确，是最常使用的检测方法。

对这种多个同分异构体的混合物的检测，现有技术采用的方式是对多个同分异构体分别单独进行分离检测，而这种检测方法会加大时间成本、检测成本，并且还会影响准确性。目前多肽等下游产业对Fmoc-L-Thr(tBu)-OL等保护氨基酸产品的质量要求很高(纯度≥99.5％，单杂≤0.1％等)，因此必需对产品中的相关杂质进行快速高效的分析，所以急需相应的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法，该方法能够在较短时间内一次性检测其各种杂质的情况，从而控制终产品的质量，具有良好的专属性和精密度。

一种分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法，包括：

将氨基酸衍生物与3种相关杂质加入容量瓶，用乙腈定容，摇动溶解，得到澄清透明溶液；

采用HPLC对澄清透明溶液进行检测，利用LUX-2手性柱作为分离载体，将流动相A和流动相B在不同的时间按照不同的比例混合，通过混合后的流动相对所述澄清透明溶液进行洗脱，并采用面积归一化法确定所述澄清透明溶液中每种物质的出峰位置以及每种物质对应的含量；

将流动相A和流动相B在不同的时间按照不同的比例混合得到对应不同的流动相包括：以1.0mL/min的流速为为基准，将流动相A和流动相B以40:60的体积比作为初始体积比，在一定时间内，将所述流动相A和流动相B的体积逐渐调整至终极体积比。

进一步地，如上所述的分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法，所述一定时间为50min；所述终极体积比为20:80。

进一步地，如上所述的分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法，所述流动相A为0.10％TFA水溶液；所述流动相B为0.10％TFA乙腈溶液。

进一步地，如上所述的分离检测氨基酸衍生物及其相关杂质的方法，所述色谱柱的尺寸为5μm 4.6mm×250mm，柱温为35℃。