[发明专利]一种用于富集、扩增尿液eccDNA的试剂盒及方法和用途

说明书

本发明公开一种用于富集、扩增尿液eccDNA的试剂盒及方法和用途，该试剂盒包括DNA提取试剂、第一内参质粒、第二内参质粒、DNA纯化试剂、eccDNA富集试剂和eccDNA建库试剂。本发明的试剂盒以及富集、扩增方法不仅有效提取尿液样本中的eccDNA，同时引入内参质粒显著提高了后续的数据分析的可靠性。此外，本发明通过转座酶随机切割eccDNA进行建库，最大程度减少对eccDNA的偏好，从而获取更多的遗传基因组信息。因此，本发明的试剂盒以及富集、扩增方法在临床中具有广泛应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于富集、扩增尿液eccDNA的试剂盒及方法和用途，特别是一种基于Tn5转座酶从尿液中提取、富集和扩增染色体外环状DNA的方法及其应用。

背景技术

染色体外环状DNA(以下简称为“eccDNA”)是指一种来源于染色体但能独立于染色体外存在的闭合环状DNA分子。随着高通量测序技术的不断发展，eccDNA的研究不断增多，其已成为具有诸多功能特征的小分子核酸。eccDNA可以通过其多样性快速重塑基因组，包括结构、功能和数量多样性，从而有效地驱动癌症和生命的进化。因此对其遗传信息的进一步探索有助于为癌症的诊断、治疗和预测等提供新思路。相较于线性DNA，eccDNA由于其环状结构，较线性DNA更加稳定。因此，也被认为是临床液体活检的可靠标志物。

尿液作为一种真正意义上的无创检测样本，其具有采集方便，不需要专业人员的操作，样本体积大，可以满足各种检测的样本量要求，同时还可以实现多个时间点的纵向取样等诸多优点，是理想的临床检测样本。然而目前还没有有效的尿液eccDNA提取、富集和扩增的方法。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种以Tn5转座酶为基础富集尿液中游离eccDNA的方法，该方法操作简便，有利于后续临床标志物开发和生物信息学分析。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒，所述试剂盒包括DNA提取试剂、第一内参质粒、第二内参质粒、DNA纯化试剂、eccDNA富集试剂和eccDNA建库试剂。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒，其中，所述第一内参质粒和第二内参质粒各自含有酶切识别位点，所述酶切识别位点包括Not I或Mss I酶切识别位点。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒，其中，所述内参质粒选自P1035质粒或P895质粒。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒，其中，所述DNA提取试剂包括低分子醇溶液。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒，其中，所述DNA纯化试剂包括纯化磁珠和80％乙醇。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒，其中，所述eccDNA富集试剂包括核酸外切酶。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒，其中，所述eccDNA建库试剂包括Tn5转座酶。

本发明的第二方面，提供第一方面所述的用于富集和扩增尿液中eccDNA的试剂盒在以下任一种中的应用：

(1)制备富集和扩增尿液中eccDNA的产品；

(2)制备检测尿液中eccDNA的产品；

(3)制备开发或筛选肿瘤相关标志物的产品；

(4)制备肿瘤进展监测与评估的产品。