[发明专利]一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株吩嗪‑1‑羧酸高产工程菌株的构建方法。以高产吩嗪‑1羧酸的QPCA‑7作为出发株，通过陆续敲除新近发现的对吩嗪‑1‑羧酸具有负调控作用的GspC、Algb等基因，将菌株吩嗪‑1‑羧酸的生产能力提升到10859.3mg/L。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种构建高产生物活性物质吩嗪-1-羧酸的工程菌株的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

当今社会全球人口迅速增长，粮食供应面临巨大压力。同时粮食的生产受到各种病菌、虫害的严重威胁，人们不得不施用大量的农药来控制农业病菌、虫害。目前施用的农药大部分是化学合成农药，虽然防治效果不错，但存在污染生态环境、不易降解等特点，不符合现代社会可持续发展的理念。生物农药是一类来源于自然界的天然抗菌杀虫剂，与化学农药相比，生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势，已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。吩嗪-1羧酸就是近年来发现的生物农药的优秀代表，1％的吩嗪-1-羧酸悬液对水稻纹枯病、水稻稻曲病、水稻稻瘟病、小麦赤霉病、黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、西瓜枯萎病、辣椒疫病等具有良好的防治效果。而且在环境中可降解。由于以上特点，吩嗪-1羧酸在2011年被中国农业部授予农药证书，并被命名为“申嗪霉素”。

目前吩嗪-1-羧酸生产方法虽有化工方法，但条件苛刻，并且向环境释放有毒有害物质，所以主要由假单胞菌中的铜绿假单胞菌生产，但铜绿假单胞菌则是目前医院中一种比较常见的机会致病菌，并不太适合作为生产菌株来推广应用，发明人前期工作(专利CN112126611A)中通过基因工程方法获得了在48h能够生产吩嗪-1-羧酸7854mg/L的工程菌株QPCA-7。但发酵效价依然不高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法。以高产吩嗪-1羧酸的QPCA-7作为出发株，通过陆续敲除新近发现的对吩嗪-1-羧酸具有负调控作用的GspC、Algb等基因，将菌株吩嗪-1-羧酸的生产能力提升到10859.3mg/L。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株，所述工程菌株是敲除工程菌株QPCA-7基因组中GspC基因和/或Algb基因而得；

所述工程菌株QPCA-7是敲除绿针假单胞菌Qlu-1基因组中的phzO基因、lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因、rpeA基因和pykF基因中的一个或多个而得；

所述绿针假单胞菌Qlu-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2020108。

本发明通过基因工程手段，提高了菌株吩嗪-1-羧酸的发酵效价，降低了吩嗪-1-羧酸的生产成本。

本发明的第二个方面，提供了一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，包括：

敲除工程菌株QPCA-7基因组中GspC基因和/或Algb基因，即得。

在一些实施例中，敲除工程菌株QPCA-7基因组中GspC基因的具体步骤包括：

采用PCR钓取并连接GspC基因的上下游片段，得到GspC-ud片段；

将所述GspC-ud片段连接质粒pk18moBsacB构建GspC基因敲除质粒pK18-GspC-ud；

将所述GspC基因敲除质粒pK18-GspC-ud导入大肠杆菌S17-1(λ)，再与绿针假单胞菌QPCA-7进行双亲杂交培养，

筛选阳性克隆，即得敲除GspC基因的菌株QPCA-8。