[发明专利]一种核酸检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a、HCR和FRET的核酸检测试剂盒，包括修饰有供体荧光标记的核酸发夹探针A、修饰有受体荧光标记的核酸发夹探针B、引发链、Cas12a蛋白和crRNA，其中，核酸发夹探针A和核酸发夹探针B能够在引发链的作用下发生杂交链式反应形成双链，核酸发夹探针A和核酸发夹探针B形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间能够发生荧光共振能量转移，同时，两者之间的距离为0～16个碱基，引发链能够在Cas12a蛋白的反式切割活性下发生裂解，Cas12a蛋白能够和crRNA结合形成靶向靶标核酸的二元复合物。

技术领域

本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

液体活检是以肿瘤生物标志物为检测对象，根据非入侵性的取样方法得到肿瘤干细胞信息内容，辅助癌症治疗的无损检测技术。ctDNA是循环肿瘤基因(循环肿瘤DNA)，是肿瘤细胞在坏死或凋亡过程中产生的，是一种特征性的肿瘤生物标志物。通过液体活检对如EGFR阳性患者的T790M突变等的ctDNA进行定量检测，有助于检测出患者血液中的肿瘤细胞。但是，由于癌症早期患者血液中ctDNA的含量非常低，其定量检测具有挑战性。

目前，传统的通过液体活检对ctDNA进行定量检测的技术主要有聚合酶链反应(PCR)、微珠状乳剂扩增和磁性技术(BEAMing)、DNA测序等。但是，这些方法具有测试时间长、程序繁琐以及成本高昂等问题，这使得基于ctDNA的液体活检在临床应用中存在一定的局限性。因此，有必要开发一种灵敏度高、实时、步骤简单且低成本的ctDNA定量检测方法用于癌症筛查和诊断，为决定癌症的临床治疗、评估癌症的治疗效果、监测癌症的复发转移进展提供关键信息。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a、HCR(杂交链式反应)和FRET(荧光共振能量转移)的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括修饰有供体荧光标记的核酸发夹探针A、修饰有受体荧光标记的核酸发夹探针B、引发链、Cas12a蛋白和crRNA；所述核酸发夹探针A和核酸发夹探针B能够在引发链的作用下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针A和核酸发夹探针B形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间能够发生荧光共振能量转移，同时，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为0～16个碱基；所述引发链能够在Cas12a蛋白的反式切割活性下发生裂解；所述Cas12a蛋白能够和crRNA结合形成靶向靶标核酸的二元复合物；所述供体荧光标记的发射波长能够作为受体荧光标记的激发波长。

在本发明的一种实施方式中，所述供体荧光标记包括羧基荧光素、Dabcyl或Cy3；所述受体荧光标记包括四甲基罗丹明、Glu(荧光标记葡萄糖)或Cy5。

在本发明的一种实施方式中，所述供体荧光标记为羧基荧光素，所述受体荧光标记为四甲基罗丹明。

在本发明的一种实施方式中，所述核酸发夹探针A和核酸发夹探针B形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为2～5个碱基。

在本发明的一种实施方式中，所述核酸发夹探针A和核酸发夹探针B形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为3个碱基。

在本发明的一种实施方式中，所述核酸检测试剂盒还包括缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液包括NEB缓冲液或PBS缓冲液。