[发明专利]一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合

权利要求书

1.一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测S基因6个位点的特异性引物探针，所述S基因6个位点为69-70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位点；

69-70del位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.3；反向引物序列为SEQ IDNo.6；探针序列为SEQ ID No.7；

E484K位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.9；反向引物序列为SEQ IDNo.13；探针序列为SEQ ID No.14；

K417N位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.16；反向引物序列为SEQ IDNo.17；探针序列为SEQ ID No.18；

N501Y位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.19；反向引物序列为SEQ IDNo.23；探针序列为SEQ ID No.26；

P681H位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.28；反向引物序列为SEQ IDNo.32；探针序列为SEQ ID No.35；

K417T位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.37；反向引物序列为SEQ IDNo.38；探针序列为SEQ ID No.39。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括ORF1ab基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.40；反向引物序列为SEQ ID No.41；探针序列为SEQ ID No.42。

3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括内标RNaseP基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.43；反向向引物序列为SEQ ID No.44；探针序列为SEQ ID No.45。

4.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物为ARMS引物，其3’末端碱基与突变位点处碱基互补；特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团；光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5、CY5中的任意一种或几种；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB中的任意一种或几种。

5.一种用于新型冠状病毒S基因6种突变的检测试剂盒，包括以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、权利要求1所述的引物探针组合、去RNA酶水。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增反应液包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs。

7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。

8.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，检测液中的引物探针组合，引物浓度为0.005～1.0μmol；探针浓度为0.005～1.0μmol。

9.一种用于新型冠状病毒S基因6种突变检测的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1、模板RNA的提取：样本核酸提取；

S2、配制试剂反应体系：

按照以下组成配制，将核酸扩增反应液、酶混合液及如权利要求1所述引物探针组合配制成混合液，分装，加入模板RNA，用去RNA酶水补足至50微升，充分混匀，离心，放入荧光PCR仪；

反应体系为50μL，组成如下：

S3、设置扩增程序并检测：

进行RT-PCR扩增，结果判读。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，结果判读具体为：

(1)阴阳性判定：

内标RNaseP，Ct≤37.0时检测结果可靠，新型冠状病毒ORF1ab，Ct≤40.0为2019-nCov阳性；S基因突变位点，Ct≤40.0且与ORF1ab的ΔCt8.0则该位点为阳性，即突变型，否则为阴性，即野生型；

(2)变异株型别判定：

针对检测为阳性的位点，即突变位点进行变异株型别判定，变异株Alpha含有69-70del、N501Y、P681H突变，变异株Beta含有E484K、K417N、N501Y突变，变异株Gamma含有E484K、N501Y、K417T突变，变异株Omicron含有K417N、N501Y、P681H突变或K417N、N501Y、P681H、69-70del突变。