[发明专利]一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合

说明书

本发明涉及一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物及探针组合。本发明采用ARMS法(扩增受阻突变系统)以新冠S基因为靶序列，设计69‑70del缺失位点、E484K位点、K417N位点、N501Y位点、P681H位点、K417T位点的突变型引物，以ORF1ab基因(内控)为靶序列设计引物，探针采用不同荧光进行标记。根据突变型和内控基因荧光PCR检测Ct值的差异(ΔCt)实现对冠状病毒S基因69‑70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位点突变检测。本发明具有以下优点：(1)特异性强；(2)灵敏度高；(3)成本低，通量高；(4)快速省时，准确性高；(5)操作简单。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合。

背景技术

SARS-CoV-2是单股正链RNA病毒，直径60～140nm，具有5个必需基因，分别针对核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)。S蛋白是重要的结构蛋白，S蛋白上的特定位点的突变，影响病毒与人体细胞的亲和力，改变病毒的传染性和致病性，在病毒传播中起着十分重要的作用。对S基因突变病毒的快速鉴定有助于进一步监控病毒的传播及演化进程。因此，必须建立快速、灵敏的突变基因检测方法才能实现新型冠状病毒S基因突变体的快速有效鉴定。

WHO提出的VOI是指出现可能或已知影响传染性、疾病严重程度、免疫逃逸、诊断和治疗的特异位点突变的病毒株，在多个国家的相对流行率不断增加，全球公共卫生面临新的风险。VOC是指符合VOI定义，经评估证实存在以下至少一种特点的变异株：①病毒传染性增加；②致病性增强或临床症状改变；③公共卫生及社会措施或诊断、疫苗、治疗方法的有效性降低。目前指定的VOCs有Delta、Omicron变异株，其中Omicron变异株于2021年9月下旬，在南非发现。该突变体有多个刺突蛋白缺失和突变，新冠病毒奥密克戎变异株在病毒刺突(Spike)蛋白突变较多，同时具有前4个变异株Alpha、Beta、Gamma和Delta刺突蛋白的重要氨基酸突变位点，包括增强细胞受体亲和力和病毒复制能力的突变位点，导致其具有极强的传播能力。Alpha(B.1.1.7)变异株共有17个突变，其中S蛋白上有9个突变：Δ69/70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H，另外也可能合并E484K、S494P和K1191N。N501Y的突变是S蛋白RBD第501位氨基酸由天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，该突变不仅改变RBD构象使SARS-CoV-2对人体ACE2受体亲和力增加，还可增加病毒粒子与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序(RGD motif)结合位点的亲和力。Δ69/70影响RBD构象，叠加增强S蛋白对ACE2受体亲和力，增强病毒传染性并有助于病毒发生免疫逃逸，这种缺失也是某些检测试剂盒未能检测到病毒S基因的原因。S蛋白只有被切割，暴露出开放结构区域，才能与人体ACE2受体结合。P681H是S蛋白受体S1和S2区域连接处的弗林蛋白酶切割位点的一部分。该连接处的变化增强了S蛋白上切割位点对蛋白酶的敏感性，能明显提高病毒的传播效率。B.1.351变异株的S蛋白上具备8个突变或位点缺失：D80A、D215G、Δ241/242/243、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。N501Y及K417N、E484K突变，都可改变RBD构象，增强与ACE2受体亲和力，增加传染性。Gamma(P.1)变异株的S蛋白上存在11个突变，除D614G外，还包括RBD中的K417T、E484K和N501Y；NTD中的L18F、T20N、P26S、D138Y和R190S；和靠近Furin裂解位点的H655Y。研究人员总结了欧洲多个国家COVID-19病例并分析了B.1.1.7、B.1.351和P.1的临床特点，感染这三种变异株病例的住院率显著高于非VOC病例，入住ICU的可能性分别是非VOC病例的2.3、3.3和2.2倍，并显示在各年龄段有病情加重风险。因此，确定S蛋白的突变类型，快速识别多种SARS-CoV-2变异株，可以防止潜在的广泛感染和变异的流入。