[发明专利]一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用

说明书

本发明属于辣椒基因研究的技术领域，具体涉及一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用。针对目前辣椒果实发育内参基因缺乏的现状，依据转录组数据，利用实时荧光定量PCR技术对辣椒果实不同生长发育期、果实部位及组织的基因表达量进行分析的现状，对内参基因进行广泛筛选并使用了多种统计分析方法和综合比较各个内参基因的稳定性，根据基因序列设计相应的实时荧光定量PCR引物，扩增效率高，筛选出一年生辣椒发育过程中稳定适合且稳定的内参基因CT8，并且开发设计了辣椒果实相关基因研究领域的实时荧光定量PCR高效扩增引物，为辣椒果实发育过程中目标基因表达分析、筛选及时空表达验证提供了相对有效的内参基因用于校准。

技术领域

本发明属于辣椒基因研究的技术领域，具体涉及一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用。

背景技术

实时荧光定量PCR技术因其具有高效、准确率高和重复性良好等优点被广泛应用于基因表达量分析，但合适且稳定的内参基因是准确计算目标基因相对表达量的关键因素。理想状态下，内参基因应该在同一物种、不同组织器官及其不同生长阶段都能稳定表达，其表达量不受内外因素所影响。实际上，任意内参基因的表达量都是相对的，同一物种同一内参基因的表达量常常受内外因素所影响，因此在进行相关研究时应该就不同的实验条件、实验环境和实验目的选择适宜且稳定的内参基因。

辣椒是世界性蔬菜之一，也是我国种植面积最为广泛的蔬菜作物。辣椒不仅是餐厅厨房的佐食和调料，还是化妆品、药品和催泪瓦斯等重要产品的原料，其中一年生辣椒(Capsicum annuum L.)是种植最为广泛的栽培种之一。果实品质对辣椒的商品价值至关重要，对果实发育、营养和风味相关品质性状的基因进行时空表达量分析研究是改善植物果实品质的重要理论基础。

2011年Hongjian Wan等以甜椒PBC631B为材料进行内参基因筛选，研究表明β-TUB和UBI-3在所有处理中表达最稳定，不同组织器官中UBI-3和GAPDH表达稳定，ACT和UBI-1则表现出不稳定不宜做内参基因。2012年Wang Shu Bin等以胞质雄性不育系辣椒CMS 21A作为试验材料。分别采取成熟植株根、茎、叶、花和非生物胁迫及激素处理幼苗，对ACT、ACT1、ACT2、18S rRNA、PPR1、TEF1A、EF1α、UEP、CYC和GAPDH等10候选内参基因进行筛选。分析结果显示成熟植株不同组织适宜内参基因为ACT，非生物胁迫及激素处理组适宜内参基因为EF1α，所有样品中适宜内参基因则为EF1α和UEP。两者选择的同为一年生辣椒成熟植株为材料，ACT在CMS 21A成熟植株组织器官中表达稳定，适宜作为内参基因，在PBC631B成熟辣椒植株中却不适宜作为内参基因使用。因此，如果仍使用缺乏系统验证的ACT作为内参基因将会严重影响辣椒果实发育相关基因表达分析的准确性；另一方面，随着转录组的测序的迅猛发展，基于转录组数据筛选开发出稳定适宜的新内参基因是解决当前困境的良好选择。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一年生辣椒(Capsicum annuum L.)不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用，所筛选的内参基因满足对辣椒果实发育过程中相关基因研究的数据支撑。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一年生辣椒(Capsicum annuum L.)不同果实发育时期的内参基因，所述内参基因为EIF，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特异性引物如SEQ ID NO.30和SEQID NO.31所示。

本发明还提供了上述内参基因CT8或其特异性引物在制备一年生辣椒不同果实发育时期检测试剂盒的应用。

本发明还提供了一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因的筛选方法，包括如下步骤：

1)果实预处理：获取不同生长发育时期的一年生辣椒果实，研磨成粉末；

2)提取RNA：提取不同生长发育时期的辣椒果实粉末的RNA；