[发明专利]苯妥英检测试剂盒

说明书

本申请涉及苯妥英检测试剂盒。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

本申请是中国专利申请号201911403882.5(申请日2019年12月31日)《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途》的分案申请。

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在苯妥英检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

苯妥英(Phenytoin，PTN)，作为半抗原的具体实例，苯妥英是一种抗癫痫的外源性小分子药物。正常人的血清与血浆中不存在此物质，临床一般使用其钠盐形式。

苯妥英钠作为传统抗癫痫药物，药理作用机制主要是阻滞电压依赖性Na⁺通道，减少Na⁺内流稳定神经元细胞膜，降低其兴奋性，从而阻止局部异常放电向正常脑组织扩散。

苯妥英钠口服后1.5至30小时达峰浓度，一般连续给药6至10天可达有效血药浓度，其价格低廉、疗效确切，目前在临床广泛使用。但是，因其药代动力学特殊，治疗窗口狭窄，易导致药物过量而中毒，且中毒后临床表现多样，易误诊。所以，在临床诊断的过程中，需要不断的监测苯妥英在血中的药物浓度。

通常血药浓度在10-20μg/ml时能够达到最佳的治疗效果，且不会对人体产生毒害作用。而血药物浓度高于20μg/ml时，能够对人体的肝脏及肾脏产生毒性，轻则昏迷，重则死亡。一般在停止用药2-4周，经人体肝脏及肾脏代谢后，能够将苯妥英的血药浓度降低至0.5μg/ml或者更低的水平。

目前已知的苯妥英检测方法主要有：酶联免疫吸附法、均相酶免疫测定法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、荧光偏振法等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)检测为主。

均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH-苯妥英)与非标记抗原(苯妥英)，竞争与定量的抗体(苯妥英抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中苯妥英的含量。

发明内容