[发明专利]一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用

权利要求书

1.一种以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：采集唾液样本；

步骤2：采用LPKS法提取唾液样本基因组DNA：在所述唾液样本中分步并依次加入溶菌酶、SDS和蛋白酶K，在各自适合的工作温度下进行反应，经过三步水浴法裂解细菌和释放DNA，离心，获得含DNA的上清液，用两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即得。

2.根据权利要求1所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶的浓度为100mg/mL，37℃水浴10-60min。

3.根据权利要求1所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，先56℃水浴10-60min，再转入65℃水浴10-60min。

4.根据权利要求1-3任一项所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述LPKS法提取唾液样本基因组DNA的方法包括：

唾液500μL与500μL重悬液混匀，离心去上清；

加入150μL重悬液重悬沉淀，加入10-20μL100mg/mL溶菌酶，37℃水浴10-60min；

加入450μL提取液，再加入5-20μL 20mg/mL蛋白酶K，56℃水浴10-60min；

转入65℃水浴10-60min，充分裂解细菌；

12000rpm/min离心10min，取上清；

加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心去上清；

75％乙醇洗涤DNA沉淀；

用40μL含50μg/mL RNAase的无菌水溶解DNA，即得；其中：

所述重悬液的组成为：0.1M Tris-HCl，pH 6.8；10mM EDTA，pH 8.0；

所述提取液的组成为：0.1M Tris-HCl，pH 8.0；2.5mM EDTA，pH 8.0；250mM NaCl；0.5％SDS。

5.根据权利要求1所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤2中所述LPKS法提取唾液样本基因组DNA的浓度不小于60ng/μL。

6.权利要求1至5任一项所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法在以非诊断和治疗目的大规模唾液细菌基因或基因组检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以非诊断和治疗目的的检测牙龈卟啉单胞菌含量的方法包括：

(1)按照权利要求1至5任一项所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法提取待测样本DNA，作为PCR模板；

(2)分别使用牙龈卟啉单胞菌和通用菌的检测引物进行TaqMan探针实时荧光定量PCR反应，对牙龈卟啉单胞菌16S rRNA基因特异序列和16S rRNA基因保守区域序列扩增，其中所述牙龈卟啉单胞菌的检测引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述通用菌的检测引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；

(3)根据PCR反应的扩增结果，分别得到牙龈卟啉单胞菌Ct值和总菌Ct值，根据公式2^ΔCt(ΔCt＝Ct(总菌)–Ct(牙龈卟啉单胞菌))得到牙龈卟啉单胞菌的相对含量。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述待测样本为口腔唾液。