[发明专利]一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用

说明书

本发明公开了一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用，属于基因检测领域。该提取方法包括：采集唾液样本，用LPKS法提取唾液样本基因组DNA，即在唾液样本中分步并依次加入溶菌酶、SDS和蛋白酶K，在各自适合的工作温度下进行反应，经过三步水浴法裂解细菌和释放DNA，离心，获得含DNA的上清液，用两倍体积的无水乙醇沉淀DNA。本发明建立一种高效、简易、环保且低成本的唾液细菌基因组DNA提取方法，用LPKS法提取唾液细菌基因组DNA的浓度和质量能够满足宏基因组测序和定量PCR检测的要求，具有很高的推广应用价值，有助于更广泛地开展口腔致病菌相关的临床研究及检测。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用。

背景技术

口腔中定植有大量的微生物，当口腔微生物群落与宿主间生态关系失衡时可诱发多种口腔及全身系统性疾病。口腔微生物群多以生物膜形式定植在各生态区行使功能，附着在膜表面上的菌群会持续脱落到唾液中，而唾液中的微生物又不断在各个生态区定植。因此，唾液微生物群可作为口腔微生物群的“指纹”，唾液是一个潜在的巨大生物标志物储存库。此外，唾液来源丰富，采集过程具有无创无痛、方便快捷、无血源性疾病传播等优势，是理想的生物学样本。

唾液细菌基因/基因组检测在疾病风险评估和辅助诊断方面已有很多研究，相关结果具有非常重要的潜在应用价值，而建立高效、低成本的唾液细菌基因组DNA提取方法是开展大规模口腔致病菌相关临床研究与检测的前提。综合文献分析，目前细菌基因组DNA提取方法主要包括：试剂盒抽提法、酚-氯仿抽提法、冰冻-煮沸法及Chelex-100抽提法等，其中试剂盒抽提法是国内外研究普遍应用的方法，具有提取效率高、质量稳定的优点，但试剂盒价格昂贵，不适用于大规模临床应用；酚-氯仿抽提法是非试剂盒抽提法中最常用的方法，但是操作步骤繁琐且易造成环境污染，不适合常规应用。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的主要目的在于提供一种唾液细菌基因组DNA的提取方法，联合溶菌酶、蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)裂解法，建立一种简单、环保、低成本、高效率的细菌基因组提取方法，被命名为溶菌酶/蛋白酶K/SDS法(LPKS法)，为开展大规模唾液细菌基因/基因组检测提供实用的技术手段。

本发明的另一目的在于提供一种唾液细菌基因组DNA的提取方法在大规模唾液细菌基因/基因组检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明还提供一种以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：采集唾液样本；

步骤2：采用LPKS法提取唾液样本基因组DNA：在所述唾液样本中分步并依次加入溶菌酶、SDS和蛋白酶K，在各自适合的工作温度下进行反应，经过三步水浴法裂解细菌和释放DNA，离心，获得含DNA的上清液，用两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即得。

作为优选，所述溶菌酶的浓度为100mg/mL，37℃水浴10-60min。

作为优选，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，先56℃水浴10-60min；

再转入65℃水浴10-60min，充分裂解细菌。

作为优选，所述LPKS法提取唾液样本基因组DNA的方法包括：唾液500μL与500μL重悬液混匀，离心去上清；加入150μL重悬液重悬沉淀，加入10-20μL100mg/mL溶菌酶，37℃水浴10-60min；加入450μL提取液，再加入5-20μL 20mg/mL蛋白酶K，56℃水浴10-60min；转入65℃水浴10-60min；12000rpm/min离心10min，取上清；加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心去上清；75％乙醇洗涤DNA沉淀；用40μL含50μg/mL RNAase的无菌水溶解DNA，即得；其中：