[发明专利]非特异性过氧合酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种非特异性过氧合酶突变体及其编码基因和应用，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明中，通过对非特异性过氧合酶rDcaUPO进行定点突变后发现，突变体rDcaUPO‑A161C对双氧水的耐受性增强，在10mM双氧水中孵育14h，半衰期为野生型的6倍，在100mM的双氧水中孵育处理2h后，仍能维持较高的酶活。因此，本发明的非特异性过氧合酶突变体可在生物催化过程中应用，具有良好的稳定性能，可在应用过程中寿命延长和提高催化效率，更适用于工业领域上的应用。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种双氧水耐受的非特异性过氧合酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

脂肪酸作为建筑材料越来越重要，因为它们可以很容易地从生物质(植物油)中获得，其纯度可以用于随后的化学或酶转化。羟基的插入赋予这些化合物新的性质，如更高的反应性和更高的溶剂可混溶性。羟基脂肪酸(HFAs)是化学结构中含有一个或多个羟基的脂肪酸，广泛分布在动物、植物和微生物体内。根据羟基在脂肪酸链上的不同位置，羟基脂肪酸可分为羧基端羟基脂肪酸(α～β)、链内羟基脂肪酸(ω-1，ω-2，ω-3……)、末端脂肪酸(ω)。羟基脂肪酸是合成香料、抗生素、增塑剂、表面活性剂等的起始物质，也可用于合成聚合物、树脂和肥皂，用作润滑油和油漆的添加剂，以及胶水和表面涂层生产的原料。

现有报道中，可催化脂肪酸加羟基的酶主要集中在水合酶类和氧化酶类。其中水合酶只能羟化不饱和脂肪酸的双键，催化底物范围较窄。而P450单加氧酶在反应过程中需要添加昂贵的辅酶因子NAD(P)H，反应路线相对复杂。高昂的成本极大地限制了P450单加氧酶在羟基脂肪酸工业化生产中的应用。因此，水合酶和P450单加氧酶均难以满足食品与日化工业对羟基脂肪酸产品的极大需求。

非特异性过氧合酶(Unspecificperoxygenase，UPO，EC1.11.2.1)是一类高度糖基化的硫代血红素酶，归类于血红素硫酸盐过加氧酶(HTP)超家族，是真菌中普遍存在的生物催化剂，就底物光谱和反应多样性而言，是最通用的氧功能化酶。在温和条件下，能氧化惰性C—H键是UPO最具有特点的催化特点之一，UPO催化过程中不需要添加辅酶因子，催化过程仅需利用H₂O₂作为氧供体，是现有氧化功能化反应研究中化学和酶催化剂的潜在替代品，在食品原料加工、香精香料、医药行业、环境治理等领域应用潜力巨大。

非特异性过氧合酶的H₂O₂耐受性差也是限制UPO工业化应用的瓶颈之一。高浓度的H₂O₂可以提高UPO的催化速率，同时，H₂O₂的原位再生可以保证UPO能够持续稳定的催化反应。H₂O₂的光化学法和电化学法原位再生受限于设备与材料，成本高昂，而酶级联催化法需要两个甚至多个酶，也要多方位考虑级联反应的影响因素。通过分子改造提高UPO对H₂O₂的耐受性无疑是最好的选择，这也为UPO成为更重要的氧化酶工具奠定基础，因此，开发双氧水耐受的非特异性过氧合酶在理论和工业应用上具有重要的意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种双氧水耐受的非特异性过氧合酶突变体及其编码基因和应用。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种非特异性过氧合酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面，提供了上述非特异性过氧合酶突变体的编码基因。

本发明的第三方面，提供了一种插入有上述非特异性过氧合酶突变体的编码基因的重组表达载体。

本发明的第四方面，提供了一种转化有上述重组表达载体的重组工程菌。